【摘要】：目的:本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察葛黃顆粒含藥血清對(duì)乙醇誘導(dǎo)的L-02細(xì)胞的影響,以探討其對(duì)ALD的保護(hù)作用和分子機(jī)制。方法:1、含藥血清的制備:雄性Sparague-Dawley大鼠(簡(jiǎn)稱SD大鼠)60只,體重180-220g,隨機(jī)分為3組,每組20只,分別為空白對(duì)照組、葛黃顆粒組(3.1g生藥/100g體重/天),美他多辛組(0.1g/100g/天),每日給藥2次,早晚各一次,連續(xù)給藥5天。禁食12h在末次給藥前,但不限制飲水,于最后一次給藥后1h,麻醉動(dòng)物,腹主動(dòng)脈取血制備含藥血清。2、造模及干預(yù):CCK8法篩選出最佳乙醇濃度范圍。同時(shí)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞上清液AST、LDH,結(jié)合CCK8結(jié)果,以確定造模時(shí)間及造模的乙醇濃度。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、葛黃顆粒高劑量組(高劑量組)、葛黃顆粒中劑量組(中劑量組)、葛黃顆粒低劑量組(低劑量組)、美他多辛組(陽(yáng)性對(duì)照組),細(xì)胞接種24h后,正常組加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液,模型組在上述基礎(chǔ)上加入乙醇,另外各組加入乙醇及不同劑量的含藥血清,干預(yù)24h后,收集細(xì)胞上清液及細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的檢測(cè)。3、檢測(cè):細(xì)胞上清液AST、LDH用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè),細(xì)胞凋亡用流式細(xì)胞儀檢測(cè),檢測(cè)Fas、FasL、Caspase3、Caspase8 mRNA的表達(dá)用RT-PCR法,Fas、FasL蛋白的表達(dá)情況用免疫組化法觀察。結(jié)果:1、模型建立:運(yùn)用3%的乙醇干預(yù)L-O2肝細(xì)胞24h,AST、LDH含量升高,肝細(xì)胞體積稍增大,懸浮的細(xì)胞較前稍增多,成功建立酒精性肝損傷l-02細(xì)胞模型。2、在模型組,l-o2細(xì)胞的凋亡率顯著增高(p0.05),經(jīng)含藥血清干預(yù)后,凋亡率在中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組中的表達(dá)明顯降低(p0.05),中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組之間差異顯著(p0.05),高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(p0.05)。3、在模型組中,l-02細(xì)胞上清液的ast、ldh的含量及fas、fasl、caspase3、caspase8的基因表達(dá)顯著升高(p0.05),經(jīng)含藥血清干預(yù)后,這些指標(biāo)在中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組中的表達(dá)明顯降低(p0.05),中劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組之間差異顯著(p0.05),高劑量組和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(p0.05)。4、fas、fasl蛋白陽(yáng)性的表達(dá)可以在各組肝細(xì)胞的細(xì)胞膜上見(jiàn)到,其中棕黃色染色較淺的是正常組,而模型組染色最深,高、中、低劑量組染色均較模型組變淺,其表達(dá)呈現(xiàn)出劑量依賴性降低。陽(yáng)性對(duì)照組染色也較模型組變淺。結(jié)論:1、3%的乙醇處理l-o2肝細(xì)胞24h后可以成功誘導(dǎo)肝細(xì)胞受損,顯微鏡下觀察肝細(xì)胞體積稍增大,懸浮的細(xì)胞較前稍增多,表明酒精性肝損傷細(xì)胞模型復(fù)制成功。2、葛黃顆粒含藥血清可以降低細(xì)胞上清液中ast、ldh的含量,改善肝功受損情況,表明其對(duì)酒精性肝損傷有較好的保護(hù)作用。3、葛黃顆粒含藥血清可下調(diào)fas、fasl、caspase3、caspase8mrna的表達(dá),減少fas、fasl蛋白的表達(dá),減少凋亡率,提示其對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用可能與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

圖 1 不同濃度乙醇作用于人 L-02 肝細(xì)胞 6h、12h、24h 細(xì)胞活力的比較.2 乙醇作用時(shí)間的確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（表 6，圖 2），用不同濃度的乙醇作用于 L-02 細(xì)胞，分于 6h，12h，24h 收集細(xì)胞上清液測(cè)定 AST、LDH，隨著乙醇濃度的增加，ST、LDH 含量增加。僅當(dāng)乙醇濃度為 2.5%、3%、5%時(shí)，作用時(shí)間為 24h AST、LDH 含量與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)合細(xì)胞力及顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察，最終選取 24h 作為乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷的適時(shí)間。 6 不同濃度乙醇作用于人 L-02 肝細(xì)胞 6h、12h、24h 后 AST、LDH 含量( x±s，n=4)6h 12h 24hAST(U/L) LDH(U/L) AST(U/L) LDH(U/L) AST(U/L) LDH(U/L)

圖 2 不同濃度乙醇作用于人 L-02 肝細(xì)胞 6h、12h、24 后 AST、LDH 含量的比較2 乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建顯微鏡下觀察可見(jiàn)，模型組通過(guò)含 3%乙醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 24h 后，其肝細(xì)胞體積稍增大，懸浮的細(xì)胞較正常組稍增多（圖 3）。

圖 2 不同濃度乙醇作用于人 L-02 肝細(xì)胞 6h、12h、24 后 AST、LDH 含量的比較2 乙醇誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷模型的構(gòu)建顯微鏡下觀察可見(jiàn)，模型組通過(guò)含 3%乙醇的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 24h 后，其肝細(xì)胞體積稍增大，懸浮的細(xì)胞較正常組稍增多（圖 3）。

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本文編號(hào)：2783588