【摘要】：目的雷公藤紅素是中藥雷公藤的重要生物活性成分,發(fā)揮著多種藥理作用,在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景。明確雷公藤紅素作用機制,是其臨床轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)。目前已發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素作用具有多分子靶點特性,但其如何影響這些靶點存在兩種觀點:一是雷公藤紅素作用于少數(shù)共同上游靶點,繼而影響多個下游靶點;二是無共同上游靶點,雷公藤紅素直接作用于所有靶點。本項目通過檢驗雷公藤紅素影響4種轉(zhuǎn)錄因子是否存在共同上游靶點,探索上述觀點一是否合理。項目中所涉及的4種轉(zhuǎn)錄因子分別為:NF-κB、HSF-1(及受其調(diào)控的HSP70)、Nrf2(及受其調(diào)控的HO-1)和HIF-1,因為這4種因子前人研究較多,且它們基本能解釋雷公藤紅素的各種藥理作用。本項目所研究的上游靶分子為MD2和HSP90,因為已有研究證明雷公藤紅素能結(jié)合這兩種分子,且其他研究提示這兩種分子可能調(diào)節(jié)前述4種轉(zhuǎn)錄因子。本研究旨在進一步揭示雷公藤紅素發(fā)揮治療作用的分子機制,為下一步研究提供基礎(chǔ)。方法本課題用HepG2細胞作為研究模型,首先篩選雷公藤紅素對該細胞的安全有效劑量;其次,研究雷公藤紅素對HepG2細胞NF-κB、HSF-1(及所調(diào)控的HSP70)、Nrf2(及所調(diào)控的HO-1)和HIF-1的影響;再次,使用NF-κB抑制劑PDTC或直接下調(diào)MD2表達,檢測其對上述4種轉(zhuǎn)錄因子的影響,并與雷公藤紅素作用相比較;最后,進一步探索使用HSP90抑制劑17-AAG或直接干擾HSP90表達,觀察對上述4種轉(zhuǎn)錄因子的影響。結(jié)果雷公藤紅素對HepG2細胞的半抑制濃度(IC_(50))為3.32μM。雷公藤紅素能抑制NF-κB磷酸化,并誘導(dǎo)HSF-1(HSP70)、HO-1和HIF-1表達,且存在時間劑量依賴效應(yīng)。使用PDTC對NF-κB、HSF-1(HSP70)和HO-1的影響,與雷公藤紅素相同,但HIF-1變化與使用雷公藤紅素不同;下調(diào)MD2后,只有NF-κB變化與雷公藤紅素作用一致,說明MD2不是其調(diào)控上述4種轉(zhuǎn)錄因子的共同上游靶點。而使用17-AAG對NF-κB和HSF-1(HSP70)的影響,與雷公藤紅素相同;下調(diào)HSP90后,只有NF-κB變化與雷公藤紅素作用一致,說明HSP90也不是其調(diào)控上述4種轉(zhuǎn)錄因子的共同上游靶點。此外,我們還發(fā)現(xiàn)抑制NF-κB和抑制HSP90可能存在正反饋關(guān)系,具體機制尚不清楚。結(jié)論本課題再次證實了雷公藤紅素能調(diào)控NF-κB、HSF-1(及所調(diào)控的HSP70)、Nrf2(及所調(diào)控的HO-1)和HIF-1表達,但MD2和HSP90均不是雷公藤紅素發(fā)揮這些作用的共同上游靶點。本項目支持雷公藤紅素藥理作用是通過多靶點、多通路實現(xiàn)的,但不支持存在一個共同上游靶點。因此,對雷公藤紅素調(diào)控這4種轉(zhuǎn)錄因子靶點的機制應(yīng)該分別研究。此外,雷公藤紅素兩個主要作用,即抑制NF-κB和抑制HSP90之間可能存在正反饋關(guān)系,具體機制需要進一步研究。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

素對 HepG2 細胞的安全有效劑量。HepG2 細胞鋪板后，經(jīng)不同濃度 小時，檢測細胞存活率。統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤形式，每組樣本藤紅素；與對照組相比，*表示 P<0.05，**表示 P<0.01。對 HepG2 細胞 4 種轉(zhuǎn)錄因子（或調(diào)控產(chǎn)物）的影響表明，雷公藤紅素對不同細胞內(nèi)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子的影響不盡相賴效應(yīng)。他人研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素能抑制細胞內(nèi) NF-κB 活該信號通路下游靶基因的調(diào)控表達；同時，雷公藤紅素促0 表達和熱休克反應(yīng)；在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，雷公藤紅素活化而在調(diào)控 HIF-1 上，雷公藤紅素對其影響尚不統(tǒng)一。因此，所研究的 HepG2 細胞中，雷公藤紅素對這 4 種轉(zhuǎn)錄因子（。

圖 2.1 雷公藤紅素對 HepG2 細胞 NF-κB 的影響。HepG2 細胞鋪板貼壁后，經(jīng)不同濃度的雷公藤紅素處理一定時間，Western Blot 檢測相關(guān)蛋白表達量。圖中上方為 Western Blot 檢測結(jié)果，下方為相應(yīng)條帶密度直方圖（條帶密度已經(jīng)過內(nèi)參矯正）。統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤形式，每組樣本實驗至少重復(fù) 3 次。Cel：雷公藤紅素；與對照組相比，*表示 P < 0.05，**表示 P < 0.01。

.2 雷公藤紅素對 HepG2 細胞 HSF-1 及 HSP70（受 HSF-1 調(diào)控）的影響。HepG2 細胞鋪經(jīng)不同濃度的雷公藤紅素處理一定時間，Western Blot 檢測相關(guān)蛋白表達量。A：HSF-1（p-HHSP70（受 HSF-1 調(diào)控），每組圖中上方為 Western Blot 檢測結(jié)果，下方為相應(yīng)條帶密度帶密度已經(jīng)過內(nèi)參矯正）。統(tǒng)計數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤形式，每組樣本實驗至少重復(fù) 3 次藤紅素；與對照組相比，*表示 P < 0.05，**表示 P < 0.01。

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本文編號：2783566