【摘要】：東北林蛙(Rana dybowskii),以其多種生物活性功能引起國內(nèi)外學者的廣泛重視與研究。而東北林蛙的卵膠膜對于林蛙卵的孵化也具有重要作用,它有調(diào)節(jié)鈣離子濃度的作用,使卵在卵膠膜中達到最佳受精狀態(tài),抵御環(huán)境變化的能力,可以確保受精卵能夠維持正常的滲透壓,防止病菌侵入,為受精卵提供營養(yǎng)供應。不同種兩棲類的卵膠膜形態(tài)和層數(shù)不一,它們的化學成分也各不相同,東北林蛙卵膠膜中主要為粘多糖和蛋白質(zhì)等。本文以雌性東北林蛙排卵后1小時內(nèi)的林蛙卵膠膜為原材料對其部分生物活性物質(zhì)進行深入研究。由于林蛙極高的營養(yǎng)價值與藥用價值,一直以來都非常被學者們重視,對其主要產(chǎn)品如林蛙油、林蛙卵、林蛙卵油以及林蛙肉等的主要營養(yǎng)成分都有廣泛的研究,而對于林蛙卵膠膜中的常規(guī)營養(yǎng)組分含量的測定卻未見報道,所以本文測定了不同產(chǎn)地不同蛙齡的林蛙所產(chǎn)卵膠膜中水分、灰分、脂肪、蛋白質(zhì)的含量。水分含量的測定采用直接干燥法,總灰分和酸不溶性灰分含量的測定采用重量法,脂肪含量采用索氏抽提法測定,蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法進行測定。經(jīng)過實驗測定林蛙卵膠膜中卵膠膜水分含量在72%-79%之間,總灰分含量在0.59%-0.94%之間,酸不溶性灰分含量在0.06%-0.14%之間,脂肪含量在1.6%-3.5%之間,蛋白質(zhì)含量在147-175mg/g之間。本文建立了林蛙卵膠膜中水解氨基酸的檢測方法,衍生化試劑選用異硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate),衍生方式為柱前衍生,采用高效液相色譜儀同時測定水解氨基酸種類及含量,此方法可以方便、快捷、準確的檢測林蛙卵膠膜中水解氨基酸。同時,比較了吉林省內(nèi)不同產(chǎn)地,不同蛙齡林蛙所產(chǎn)卵膠膜中所含氨基酸的種類與各氨基酸含量的差異。除色氨酸外,其他氨基酸均有檢出,氨基酸含量最高達到10.004mg/g,其必需氨基酸占比達到24.57%。采用木瓜蛋白酶酶解法提取林蛙卵膠膜中的多糖,并用響應面分析法優(yōu)化東北林蛙卵膠膜中多糖的提取工藝。以加酶量、pH值、提取溫度、提取時間為變量,探討四個主要變量對多糖提取率的影響及其之間相互作用的關(guān)系,并對提取工藝進行優(yōu)化。通過單因素實驗結(jié)果和響應曲面的模型預測,結(jié)合實際實驗條件得到的最佳提取工藝為:加酶量74.55mg/g,pH值7.67,溫度52.55℃,提取時間2.09h,按此條件進行提取,多糖的提取率為23.84±0.07 mg/g。采用上述方法提取出的卵膠膜粗多糖除去蛋白質(zhì)及透析除去小分子雜質(zhì)后,首先用DEAE-52纖維素進行離子交換柱層析,得到精多糖I和精多糖II兩個組分,收集大的洗脫峰組份精多糖I,進行萄聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析,得到一單一組分,將該組分真空冷凍干燥得到林蛙卵膠膜精制多糖I 138.6mg。對精多糖I進行多糖類物質(zhì)基本理化性質(zhì)測定,為白色絮狀固體,易溶于熱水,不易溶于冷水,不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有機溶劑,顏色反應證明具有多糖類化合物的通性;利用紅外光譜法(IR)確定其單糖構(gòu)型并通過氣相色譜法確定其單糖組成。不含有核酸和蛋白質(zhì)等雜質(zhì),主要由甘露糖(MAN)、葡萄糖(GLU)和半乳糖(GAL)組成,各單糖質(zhì)量百分數(shù)占比分別為30.72%、29.13%、32.47%。林蛙卵膠膜精多糖I的吸濕保濕性及體外抗氧化性進行測定,以甘油、透明質(zhì)酸和聚乙二醇(PEG-400)三種常用保濕劑作對照,在24h之內(nèi),對卵膠膜精多糖I的吸濕性能力和保濕能力進行測定。以抗壞血酸為對照,對卵膠膜精多糖I的抗氧化性進行測定。結(jié)果表明,卵膠膜精多糖I具有一定的吸濕保濕能力,24h內(nèi)卵膠膜精多糖I與三種保濕劑綜合吸濕能力比較為:甘油透明質(zhì)酸卵膠膜精多糖IPEG-400,卵膠膜精多糖I與三種常用保濕劑的保濕能力對比為:透明質(zhì)酸甘油卵膠膜精多糖IPEG-400;RH81%條件下,24h內(nèi)卵膠膜精多糖I最大吸濕率為11.41%,RH43%條件下,24h內(nèi)卵膠膜精多糖I最大吸濕率達到4.96%,在24h的干燥硅膠條件下,卵膠膜精多糖I的保濕率達到40.47%。以抗氧化劑抗壞血酸為陽性對照,林蛙卵膠膜精多糖I表現(xiàn)出具有一定的還原能力,對羥自由基(·OH)、超氧陰離子(O2-·)和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)均有不同能力的清除效果,且隨著多糖濃度的增加,其對自由基的清除能力也成線性增長趨勢,當多糖濃度為2mg/mL時·OH清除率為30.43%,O2-·清除率為85.59%,DPPH·清除率為69.80%。
【學位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285
【圖文】：

圖 1.1 不同產(chǎn)地與蛙齡的林蛙卵膠膜中水分含量比較Fig.1.1Compare of Moisture content in Rana Dybowskii Jelly Coats.3.2東北林蛙卵膠膜中灰分含量采用藥典方法對靖宇、敦化、蛟河、撫松、樺甸五個不同產(chǎn)地的二齡蛙與三齡蛙卵膠灰分含量進行測定，測定結(jié)果見表，由表可知，五個產(chǎn)地不同蛙齡的卵膠膜中東北林蛙膜中總灰分與酸不溶性灰分含量有差異，灰分含量在 0.59%-0.94%之間，酸不溶性灰分.06%-0.14%之間，其中蛟河蛙卵膠膜中灰分和酸不溶性灰分含量高于其他產(chǎn)地，三齡蛙膜中灰分和酸不溶性灰分略高于二齡蛙卵膠膜�？偦曳趾孔罡唑院尤g蛙卵膠膜為 00.01%，含量最低為撫松二齡蛙卵膠膜 0.59±0.02%，酸不溶性灰分含量最高為蛟河三卵膠膜 0.14±0.01%，含量最低為撫松二齡蛙卵膠膜 0.06±0.00%。表 1-6 不同產(chǎn)地和蛙齡的林蛙卵膠膜中灰分含量Tab. 1-6 Result of Ash Content in Rana Dybowskii Jelly Coats產(chǎn)地 灰分含量(%) 酸不溶性灰分含量（%）二齡 三齡 二齡 三齡

圖 1.2 不同產(chǎn)地與蛙齡的林蛙卵膠膜中灰分含量比較Fig.1.2 Compare of Ash content in Rana Dybowskii Jelly Coats圖 1.3 不同產(chǎn)地與蛙齡的林蛙卵膠膜中酸不溶性灰分含量比較

15圖 1.3 不同產(chǎn)地與蛙齡的林蛙卵膠膜中酸不溶性灰分含量比較Fig.1.3 Compare of Acid-insoluble Ash content in Rana Dybowskii Jelly Coats.3 東北林蛙卵膠膜中粗脂肪含量采用藥典方法對靖宇、敦化、蛟河、撫松、樺甸五個不同產(chǎn)地的二齡蛙與三齡蛙卵肪含量進行測定，測定結(jié)果見表 1-7，由表可知，五個產(chǎn)地不同蛙齡的東北林蛙卵肪含量存在差異，含量在 1.6%-3.5%之間，三齡蛙卵膠膜脂肪含量同樣高于二齡蛙蛟河三齡蛙卵膠膜中脂肪含量最高為 3.49±0.06%，樺甸二齡蛙卵膠膜中脂肪含量1.58±0.11%。

【參考文獻】

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本文編號：2782606