【摘要】：目的:探索膝痹寧治療膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜纖維化的效應(yīng)機(jī)制;探明膝骨關(guān)節(jié)炎滑膜組織缺氧通過(guò)成纖維樣滑膜細(xì)胞焦亡加劇滑膜纖維化的病理機(jī)制。方法:1、構(gòu)建KOA大鼠模型,免疫熒光觀(guān)察大鼠滑膜組織缺氧標(biāo)記物哌莫硝唑,檢測(cè)滑膜封組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α的mRNA及蛋白表達(dá)水平;藥物改善KOA大鼠滑膜組織的缺氧狀況,膝關(guān)節(jié)橫徑、解剖學(xué)觀(guān)察大鼠滑膜纖維化程度,HE和天狼星紅染色切片觀(guān)察滑膜纖維化的病理變化,檢測(cè)滑膜組織纖維化標(biāo)記物:TGF-β、COL1A1、PLOD2、TIMP1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。2、提取大鼠成纖維樣滑膜細(xì)胞,LPS/ATP模擬KOA炎性環(huán)境并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡;siRNA轉(zhuǎn)染沉默HIF-1α,檢測(cè)啟動(dòng)細(xì)胞焦亡的核心:Caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD的mRNA及蛋白表達(dá)水平,ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β和IL-18的含量,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。3、構(gòu)建KOA缺氧細(xì)胞模型并用哌莫硝唑染色驗(yàn)證;siRNA轉(zhuǎn)染沉默GSDMD并檢測(cè)成纖維樣滑膜細(xì)胞中TGF-β、COL1A1、PLOD2、TIMP1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。4、構(gòu)建KOA大鼠模型,膝痹寧灌胃治療后哌莫硝唑染色觀(guān)察膝關(guān)節(jié)滑膜組織缺氧狀況,檢測(cè)HIF-1αα的mRNA及蛋白表達(dá)水平;Caspase-1(P10)、NLRP3、GS DMD的mRNA及蛋白表達(dá)水平;膝關(guān)節(jié)橫徑、解剖學(xué)觀(guān)察大鼠滑膜纖維化程度,HE和天狼星紅染色切片觀(guān)察滑膜纖維化的病理變化,TGF-β、COL1A1、TIMP1的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1、哌莫硝唑染色顯示KOA大鼠的滑膜組織比正常大鼠滑膜組織缺氧加重,HIF-1αα抑制劑地高辛(Digoxin,100 ug/kg)可抑制這種情況。KOA組滑膜組織中HIF-1α的基因和蛋白表達(dá)較正常組升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),KOA+Digoxin組對(duì)此有抑制作用(p0.05)。膝關(guān)節(jié)橫徑和解剖學(xué)觀(guān)察均提示KOA大鼠的滑膜纖維化程度加重,KOA+Digo xin組有所改善:在HE染色中,KOA+Digoxin組滑膜襯里細(xì)胞排列整齊,結(jié)締組織疏松,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少,在天狼星紅染色下,KOA組膠原沉積增加,而KOA+Digoxin組膠原沉積量相對(duì)較少;PCR檢測(cè)TGF-β、COL1A1、PLOD2、TIMP1的基因表達(dá),與正常組比較,KOA組表達(dá)量明顯增加(p0.01),KOA+Digoxin組減弱這些基因的上調(diào)(p0.01)。WB檢測(cè)上述纖維化標(biāo)記物的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)了相同的變化趨勢(shì)。2、在大鼠的成纖維樣滑膜細(xì)胞中,Caspase-1、ASC、NLRP3、GSDMD的mRNA和蛋白表達(dá)在LP S/ATP組升高(p0.05,vs正常組),而在HIF-1α siRNA組降低(P0.05,vs LPS/ATP組)。ELISA法測(cè)定培養(yǎng)上清中IL-1β和IL-18含量,HIF-1α siRNA組低于LPS/ATP組(p0.05),高于正常組(p0.05)。流式細(xì)胞術(shù)顯示,HIF-1α siRNA組細(xì)胞凋亡率明顯高于正常組(p0.01),并且顯著低于LPS/AIP組(p0.01)。3、Vehicle組和GSDMD siRNA組暴露于低氧(1%O2)24h后,哌莫硝唑染色顯示兩組細(xì)胞內(nèi)存在相似的缺氧狀態(tài)。然而,GSDMD siRNA組與Vehicle組相比,TGF-β、COL1A1、PLOD2、TIMP1的mRNA和蛋白均表達(dá)下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4、膝痹寧組滑膜組織缺氧較KOA組減輕;HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)較KOA組降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);膝痹寧組Caspase-1(p10)、NLRP3、GSDMD的mRNA及蛋白表達(dá)水平低于KOA組(p0.05);解剖學(xué)觀(guān)察提示膝痹寧組滑膜纖維化程度減輕;膝痹寧組用藥42天,56天時(shí),膝關(guān)節(jié)橫徑較KOA組減小(p0.05);HE染色和天狼星紅染色觀(guān)察到膝痹寧組滑膜襯里細(xì)胞排列整齊,結(jié)締組織疏松,炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少,膠原沉積量較少;膝痹寧組TGF-β、COL1A1、TIMP1的mRNA及蛋白表達(dá)水平低于KOA組(p0.05)。結(jié)論:1、KOA中,滑膜組織處于缺氧狀態(tài)并引起HIF-1α的升高;2、KOA中,升高的HIF-1α誘導(dǎo)成纖維樣滑膜細(xì)胞焦亡;3、KOA中,成纖維樣滑膜細(xì)胞焦亡會(huì)加劇滑膜纖維化的病程進(jìn)展;4、膝痹寧口服改善膝關(guān)節(jié)滑膜組織缺氧狀態(tài),降低HIF-1α的表達(dá),并有可能通過(guò)抑制細(xì)胞焦亡減輕滑膜纖維化。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【圖文】：

第二章實(shí)驗(yàn)研究逡逑ＫＯＡ組滑膜組織中ＨｌＦ－ｌａ的基因（圖２）和蛋白（圖３）表達(dá)較正常組升高，差統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＊ｐ＜0．0５），Ｋ0Ａ＋Ｄｉｇｏｘｉｎ組滑膜組織中ＨＩＦ－ｌａ的基因和蛋白表達(dá)較Ｋ組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＃ｐ＜邋０．０５）。逡逑Ｎｏｒｍａｌ邐ＫＯＡ邐ＫＯＡ邋＋邋Ｄｉｇｏｘｉｎ逡逑

各組大鼠右膝關(guān)節(jié)橫徑的變化情況

邐ＫＯＡ邋＋邋Ｄｉｇｏｘｉｎ逡逑圖３：各組大鼠滑膜組織ＨＩＦ－ｌａ的ｍＲＮＡ表達(dá)逡逑膝關(guān)節(jié)橫徑（圖４）和解剖學(xué)觀(guān)察（圖５）均提示ＫＯＡ大鼠的滑膜纖維化程度加重，逡逑ＫＯＡ＋Ｄｉｇｏｘｉｎ邋組有所改善（＃ｐ邋＜０．０５，ｖｓＫＯＡ組）。逡逑２６逡逑

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本文編號(hào)：2781860