【摘要】：卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤,由于早期很難發(fā)現(xiàn),患者因出現(xiàn)臨床癥狀而就診時,往往腫瘤已對周圍組織器官造成侵襲,出現(xiàn)盆、腹腔內的浸潤與轉移�；熓锹殉舶┑闹匾委熓侄�,卵巢癌的臨床化療方案以鉑類和紫杉醇為主導,化療初始時約有80%的患者顯示治療有效,然而多數(shù)患者很快就會因腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)的出現(xiàn)而使治療效果受到嚴重影響。卵巢癌易于侵襲轉移和易于產生MDR的特點,使其成為臨床上預后最差的婦科腫瘤,在充分治療的情況下,五年生存率仍低于45%,因此,研發(fā)、尋找更為有效的治療藥物,尤其是尋找在抑制腫瘤生長的同時,還能抑制腫瘤侵襲或逆轉腫瘤MDR的藥物,對卵巢癌的治療具有重大意義。本室參與研制的鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride,CH),是經由千金藤屬植物頭花千金藤中提取的千金藤素(cepharanthine,CEP)鹽化而得到的半合成化合物。多個研究證明,CEP在某些類型的腫瘤中可以表現(xiàn)出直接的抗腫瘤活性,也可以抑制某些腫瘤細胞的侵襲和轉移,另外有研究證實CEP可以有效地增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,而CEP或CH對卵巢癌相關方面的作用在國內外尚未見報道。為了探索CH對卵巢癌的作用,我們選取上皮來源的卵巢癌耐紫杉醇且具有MDR表型的A2780/Taxol細胞株和其親本的A2780細胞株為模型,采用多種實驗技術研究了CH對卵巢癌的增殖、凋亡、遷移和多藥耐藥性的影響及其作用機制,以求擴大CH可能的臨床適應證,為其進一步開發(fā)提供理論和實驗依據。根據涉及內容的相關性,本研究可以分成以下兩個部分:第一部分鹽酸千金藤堿對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制的研究目的:本部分以卵巢癌A2780細胞為受試對象,旨在研究CH對A2780細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其相關機制。方法:采用MTT法檢測不同濃度的CH作用于A2780細胞72 h的增殖抑制率,并求得IC_(50);采用MTT法檢測以IC_(50)濃度的CH作用于A2780細胞24 h、48 h、72 h和96 h的增殖抑制率;采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法,通過流式細胞儀檢測CH對A2780細胞凋亡的影響;采用劃痕實驗檢測CH對A2780細胞遷移能力的影響;采用Transwell實驗檢測CH對A2780細胞侵襲能力的影響;采用RT-qPCR實驗檢測CH對A2780細胞Bcl-2、MMP-2和MMP-9 mRNA表達水平的影響。結果:1.CH對A2780細胞的增殖抑制,隨著濃度的增加(1.25、2.5、5、10、20、40和80μM)和作用時間的延長(24、48、72和96 h),MTT結果顯示抑制率逐漸增大;CH作用于A2780細胞72 h的IC_(50)為30.21±1.24μM。2.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780細胞48 h后,流式細胞儀凋亡檢測顯示,與對照組相比,細胞晚期凋亡呈濃度依賴性增加(8.5±1.7%、12.0±1.0%、14.3±2.1%v.s.2.9±0.7%,p0.01)。3.CH以8μM的濃度作用于A2780細胞不同時間(24、48 h)后,劃痕實驗結果顯示,與對照組相比,細胞劃痕愈合率顯著降低(3.8±2.5%v.s.33.3±5.7%,7.1±1.8%v.s.43.5±1.2%,p0.01)。4.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780細胞48 h后,Transwell檢測顯示,與對照組相比,穿透基底膜進入小室下層的細胞數(shù)呈濃度依賴性減少(79.6±3.6、68.2±3.1、68.2±3.1 v.s.101.4±4.9個,p0.01),CH對A2780細胞的侵襲抑制率呈濃度依賴性增加(21.5±3.6%、32.7±3.1%、43.0±2.6%)。5.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780細胞48 h后,RT-qPCR檢測顯示,Bcl-2、MMP-2和MMP-9的mRNA表達水平均呈濃度依賴性降低。小結:本部分研究表明,CH能夠抑制卵巢癌A2780細胞的增殖,并且其抑制作用具有濃度依賴性和時間依賴性;CH能夠濃度依賴性地促進A2780細胞發(fā)生晚期凋亡,而對早期凋亡無顯著影響,其機制可能和抑制凋亡的關鍵調節(jié)基因Bcl-2的表達相關;CH能夠抑制A2780細胞的遷移和侵襲能力,其機制可能和抑制遷移的關鍵調節(jié)基因MMP-2和MMP-9的表達相關。第二部分鹽酸千金藤堿對人卵巢癌細胞多藥耐藥的逆轉及其機制的研究目的:本部分以卵巢癌耐藥細胞A2780/Taxol和其親本的A2780細胞為受試對象,旨在研究CH對A2780/Taxol細胞MDR的逆轉作用及其相關機制。方法:采用MTT法檢測不同濃度的紫杉醇作用于A2780/Taxol細胞和A2780細胞72 h的增殖抑制率,求得IC_(50)同時計算耐藥倍數(shù);采用MTT法檢測梯度濃度的紫杉醇單獨及其與CH共同作用于A2780/Taxol細胞72 h的增殖抑制率,并計算IC_(50)和逆轉倍數(shù);采用羅丹明蓄積實驗,通過流式細胞儀檢測并比較A2780/Taxol細胞和A2780細胞的羅丹明123(Rhodamine 123,Rho-123)的蓄積能力;采用羅丹明蓄積實驗,通過流式細胞儀檢測CH對A2780/Taxol細胞P-gp功能的影響;采用RT-qPCR法檢測CH對A2780/Taxol細胞MDR1 mRNA表達水平的影響;采用Western blot法檢測不同濃度CH對P-gp表達水平的影響;采用Western blot法檢測不同濃度CH對總Akt和磷酸化Akt表達的影響,考察CH對Akt磷酸化的調節(jié)作用;采用Western Blot法檢測CH單用及與PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002合用后A2780/Taxol細胞中P-gp表達的變化,考察CH對A2780/Taxol細胞PI3K/Akt通路的影響。結果:1.紫杉醇對卵巢癌耐藥株A2780/Taxol細胞和敏感株A2780細胞作用72 h的IC_(50)分別為1475.0±22.6和39.5±2.8 ng/ml;A2780/Taxol細胞的耐藥倍數(shù)為37.3。2.羅丹明蓄積實驗顯示,A2780/Taxol細胞的Rho-123蓄積能力顯著高于A2780細胞(25.1±3.1%v.s.2.6±1.1%,p0.01)。3.RT-qPCR實驗顯示,A2780/Taxol細胞MDR1 mRNA的表達水平顯著高于A2780細胞。4.梯度濃度的紫杉醇單獨或者與不同濃度(2、4、8μM)的CH共同作用于A2780細胞72 h后,MTT法檢測顯示,與紫杉醇單用組相比,CH紫杉醇合用組IC_(50)呈濃度依賴性降低(688.0±7.9、478.3±9.6、185.7±6.5 v.s.1475.0±22.6 ng/ml,p0.01),CH的逆轉倍數(shù)呈濃度依賴性增加(2.1、3.1、7.9)。5.CH以不同濃度(2、4、8μM)處理A2780/Taxol細胞2 h后,羅丹明蓄積實驗檢測顯示,與未處理組相比,CH處理組Rho-123的蓄積呈濃度依賴性升高(13.8±2.2%、17.5±1.0%、23.1±2.1%v.s.2.6±1.1%,p0.05)。6.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780/Taxol細胞48 h后,RT-qPCR實驗顯示,MDR1 mRNA的表達水平呈濃度依賴性降低。7.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780/Taxol細胞48 h后,Western blot實驗顯示,P-gp的表達水平呈濃度依賴性降低,總Akt蛋白的表達不變,磷酸化Akt蛋白呈濃度依賴性降低。8.CH與PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002共同作用后,與CH單獨作用或LY294002單獨作用相比,P-gp表達的下調顯著加強。小結:本部分研究表明,CH能夠濃度依賴性地逆轉卵巢癌耐藥株A2780/Taxol細胞的MDR,使其對紫杉醇的敏感性大大增加;CH能夠濃度依賴性地抑制A2780/Taxol細胞的P-gp功能,使其藥物轉運泵的作用大大下降;CH能夠濃度依賴性地抑制A2780/Taxol細胞MDR1 mRNA的表達、P-gp的表達和磷酸化Akt的表達;CH逆轉卵巢癌耐藥的機制可能涉及對Akt磷酸化的抑制降低了PI3K/Akt信號通路的活性,從而抑制了P-gp的表達。全文結論1.CH能夠顯著抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲,其機制可能和抑制凋亡和遷移的關鍵調節(jié)基因Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表達相關。2.CH通過抑制P-gp的表達和功能,逆轉卵巢癌的多藥耐藥。3.CH通過抑制Akt的磷酸化來抑制PI3K/Akt信號通路的活性,從而達到其逆轉P-gp介導的卵巢癌耐藥的作用。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285
【圖文】：

分 鹽酸千金藤堿對人卵巢癌細胞增殖、侵襲能力的影響及的生物學性質，包括抗炎、抗病毒和抗過敏活性[30]各種藥理學作用而引起了研究人員額外的關注。研腹水瘤和膽管癌細胞的增殖，直接發(fā)揮其抗腫瘤活G-63 細胞的遷移和侵襲能力[33]；可以引發(fā)人肝癌細的凋亡。此外多項研究證實，CEP 可以有效地增強性，并抑制人膀胱癌細胞[35]，肝癌細胞[36]、膽管癌細胞[37]中的 P-gp 表達。EP 在腫瘤治療領域的光明前景，本實驗室聯(lián)合中科學生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地，以天然單體化合物 CEP 其水溶性和療效，研制出半合成化合物鹽酸千金藤堿de，CH），其化學結構如下圖所示。

表 1.1 MTT 法檢測不同濃度的 CH 對卵巢癌 A2780 細胞的抑制率le 1.1 The inhibition rate of A2780 treated with different concentration of CH bayConcentration of CH (μM) Inhibitory rate (%)80 96.36±1.3440 79.57±3.4020 49.16±2.5410 29.24±3.665 20.23±0.872.5 15.57±5.061.25 2.71±2.00IC5030.21±1.24 μM驗數(shù)據用三次重復實驗的均數(shù)±標準差來表示。ata were expressed as mean ± SD of triplicate experiments.

第一部分 鹽酸千金藤堿對人卵巢癌細胞增殖、侵襲能力的影響及其作用機制Figure 1.1 The curve of the inhibiton of A2780 treated with CH for 72 h. were expressed as mean ± SD of triplicate experiments.為了考察 CH 對 A2780 細胞的增殖抑制和作用時間的關系，根據上一步實驗結果，我們選取接近 CH 的 IC50濃度 30 μM，進一步檢測加入 CH 后持作用不同時間（24、48、72 和 96h）對 A2780 細胞的增殖抑制。結果如圖所示，不同組間對 A2780 細胞的抑制率具有顯著性差異，并且隨著 CH 作用間的延長，對 A2780 細胞的抑制率逐步增大，表明 CH 對 A2780 細胞的抑制用具有時間依賴性。

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本文編號：2781575