【摘要】：卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤,由于早期很難發(fā)現(xiàn),患者因出現(xiàn)臨床癥狀而就診時,往往腫瘤已對周圍組織器官造成侵襲,出現(xiàn)盆、腹腔內(nèi)的浸潤與轉(zhuǎn)移�；熓锹殉舶┑闹匾委熓侄�,卵巢癌的臨床化療方案以鉑類和紫杉醇為主導(dǎo),化療初始時約有80%的患者顯示治療有效,然而多數(shù)患者很快就會因腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)的出現(xiàn)而使治療效果受到嚴重影響。卵巢癌易于侵襲轉(zhuǎn)移和易于產(chǎn)生MDR的特點,使其成為臨床上預(yù)后最差的婦科腫瘤,在充分治療的情況下,五年生存率仍低于45%,因此,研發(fā)、尋找更為有效的治療藥物,尤其是尋找在抑制腫瘤生長的同時,還能抑制腫瘤侵襲或逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的藥物,對卵巢癌的治療具有重大意義。本室參與研制的鹽酸千金藤堿(cepharanthine hydrochloride,CH),是經(jīng)由千金藤屬植物頭花千金藤中提取的千金藤素(cepharanthine,CEP)鹽化而得到的半合成化合物。多個研究證明,CEP在某些類型的腫瘤中可以表現(xiàn)出直接的抗腫瘤活性,也可以抑制某些腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,另外有研究證實CEP可以有效地增強腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,而CEP或CH對卵巢癌相關(guān)方面的作用在國內(nèi)外尚未見報道。為了探索CH對卵巢癌的作用,我們選取上皮來源的卵巢癌耐紫杉醇且具有MDR表型的A2780/Taxol細胞株和其親本的A2780細胞株為模型,采用多種實驗技術(shù)研究了CH對卵巢癌的增殖、凋亡、遷移和多藥耐藥性的影響及其作用機制,以求擴大CH可能的臨床適應(yīng)證,為其進一步開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。根據(jù)涉及內(nèi)容的相關(guān)性,本研究可以分成以下兩個部分:第一部分鹽酸千金藤堿對卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響及其機制的研究目的:本部分以卵巢癌A2780細胞為受試對象,旨在研究CH對A2780細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及其相關(guān)機制。方法:采用MTT法檢測不同濃度的CH作用于A2780細胞72 h的增殖抑制率,并求得IC_(50);采用MTT法檢測以IC_(50)濃度的CH作用于A2780細胞24 h、48 h、72 h和96 h的增殖抑制率;采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法,通過流式細胞儀檢測CH對A2780細胞凋亡的影響;采用劃痕實驗檢測CH對A2780細胞遷移能力的影響;采用Transwell實驗檢測CH對A2780細胞侵襲能力的影響;采用RT-qPCR實驗檢測CH對A2780細胞Bcl-2、MMP-2和MMP-9 mRNA表達水平的影響。結(jié)果:1.CH對A2780細胞的增殖抑制,隨著濃度的增加(1.25、2.5、5、10、20、40和80μM)和作用時間的延長(24、48、72和96 h),MTT結(jié)果顯示抑制率逐漸增大;CH作用于A2780細胞72 h的IC_(50)為30.21±1.24μM。2.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780細胞48 h后,流式細胞儀凋亡檢測顯示,與對照組相比,細胞晚期凋亡呈濃度依賴性增加(8.5±1.7%、12.0±1.0%、14.3±2.1%v.s.2.9±0.7%,p0.01)。3.CH以8μM的濃度作用于A2780細胞不同時間(24、48 h)后,劃痕實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,細胞劃痕愈合率顯著降低(3.8±2.5%v.s.33.3±5.7%,7.1±1.8%v.s.43.5±1.2%,p0.01)。4.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780細胞48 h后,Transwell檢測顯示,與對照組相比,穿透基底膜進入小室下層的細胞數(shù)呈濃度依賴性減少(79.6±3.6、68.2±3.1、68.2±3.1 v.s.101.4±4.9個,p0.01),CH對A2780細胞的侵襲抑制率呈濃度依賴性增加(21.5±3.6%、32.7±3.1%、43.0±2.6%)。5.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780細胞48 h后,RT-qPCR檢測顯示,Bcl-2、MMP-2和MMP-9的mRNA表達水平均呈濃度依賴性降低。小結(jié):本部分研究表明,CH能夠抑制卵巢癌A2780細胞的增殖,并且其抑制作用具有濃度依賴性和時間依賴性;CH能夠濃度依賴性地促進A2780細胞發(fā)生晚期凋亡,而對早期凋亡無顯著影響,其機制可能和抑制凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因Bcl-2的表達相關(guān);CH能夠抑制A2780細胞的遷移和侵襲能力,其機制可能和抑制遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因MMP-2和MMP-9的表達相關(guān)。第二部分鹽酸千金藤堿對人卵巢癌細胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)及其機制的研究目的:本部分以卵巢癌耐藥細胞A2780/Taxol和其親本的A2780細胞為受試對象,旨在研究CH對A2780/Taxol細胞MDR的逆轉(zhuǎn)作用及其相關(guān)機制。方法:采用MTT法檢測不同濃度的紫杉醇作用于A2780/Taxol細胞和A2780細胞72 h的增殖抑制率,求得IC_(50)同時計算耐藥倍數(shù);采用MTT法檢測梯度濃度的紫杉醇單獨及其與CH共同作用于A2780/Taxol細胞72 h的增殖抑制率,并計算IC_(50)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù);采用羅丹明蓄積實驗,通過流式細胞儀檢測并比較A2780/Taxol細胞和A2780細胞的羅丹明123(Rhodamine 123,Rho-123)的蓄積能力;采用羅丹明蓄積實驗,通過流式細胞儀檢測CH對A2780/Taxol細胞P-gp功能的影響;采用RT-qPCR法檢測CH對A2780/Taxol細胞MDR1 mRNA表達水平的影響;采用Western blot法檢測不同濃度CH對P-gp表達水平的影響;采用Western blot法檢測不同濃度CH對總Akt和磷酸化Akt表達的影響,考察CH對Akt磷酸化的調(diào)節(jié)作用;采用Western Blot法檢測CH單用及與PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002合用后A2780/Taxol細胞中P-gp表達的變化,考察CH對A2780/Taxol細胞PI3K/Akt通路的影響。結(jié)果:1.紫杉醇對卵巢癌耐藥株A2780/Taxol細胞和敏感株A2780細胞作用72 h的IC_(50)分別為1475.0±22.6和39.5±2.8 ng/ml;A2780/Taxol細胞的耐藥倍數(shù)為37.3。2.羅丹明蓄積實驗顯示,A2780/Taxol細胞的Rho-123蓄積能力顯著高于A2780細胞(25.1±3.1%v.s.2.6±1.1%,p0.01)。3.RT-qPCR實驗顯示,A2780/Taxol細胞MDR1 mRNA的表達水平顯著高于A2780細胞。4.梯度濃度的紫杉醇單獨或者與不同濃度(2、4、8μM)的CH共同作用于A2780細胞72 h后,MTT法檢測顯示,與紫杉醇單用組相比,CH紫杉醇合用組IC_(50)呈濃度依賴性降低(688.0±7.9、478.3±9.6、185.7±6.5 v.s.1475.0±22.6 ng/ml,p0.01),CH的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)呈濃度依賴性增加(2.1、3.1、7.9)。5.CH以不同濃度(2、4、8μM)處理A2780/Taxol細胞2 h后,羅丹明蓄積實驗檢測顯示,與未處理組相比,CH處理組Rho-123的蓄積呈濃度依賴性升高(13.8±2.2%、17.5±1.0%、23.1±2.1%v.s.2.6±1.1%,p0.05)。6.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780/Taxol細胞48 h后,RT-qPCR實驗顯示,MDR1 mRNA的表達水平呈濃度依賴性降低。7.CH以不同濃度(2、4、8μM)作用于A2780/Taxol細胞48 h后,Western blot實驗顯示,P-gp的表達水平呈濃度依賴性降低,總Akt蛋白的表達不變,磷酸化Akt蛋白呈濃度依賴性降低。8.CH與PI3K/Akt通路特異性抑制劑LY294002共同作用后,與CH單獨作用或LY294002單獨作用相比,P-gp表達的下調(diào)顯著加強。小結(jié):本部分研究表明,CH能夠濃度依賴性地逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥株A2780/Taxol細胞的MDR,使其對紫杉醇的敏感性大大增加;CH能夠濃度依賴性地抑制A2780/Taxol細胞的P-gp功能,使其藥物轉(zhuǎn)運泵的作用大大下降;CH能夠濃度依賴性地抑制A2780/Taxol細胞MDR1 mRNA的表達、P-gp的表達和磷酸化Akt的表達;CH逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥的機制可能涉及對Akt磷酸化的抑制降低了PI3K/Akt信號通路的活性,從而抑制了P-gp的表達。全文結(jié)論1.CH能夠顯著抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲,其機制可能和抑制凋亡和遷移的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表達相關(guān)。2.CH通過抑制P-gp的表達和功能,逆轉(zhuǎn)卵巢癌的多藥耐藥。3.CH通過抑制Akt的磷酸化來抑制PI3K/Akt信號通路的活性,從而達到其逆轉(zhuǎn)P-gp介導(dǎo)的卵巢癌耐藥的作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285
【圖文】：

分 鹽酸千金藤堿對人卵巢癌細胞增殖、侵襲能力的影響及的生物學(xué)性質(zhì)，包括抗炎、抗病毒和抗過敏活性[30]各種藥理學(xué)作用而引起了研究人員額外的關(guān)注。研腹水瘤和膽管癌細胞的增殖，直接發(fā)揮其抗腫瘤活G-63 細胞的遷移和侵襲能力[33]；可以引發(fā)人肝癌細的凋亡。此外多項研究證實，CEP 可以有效地增強性，并抑制人膀胱癌細胞[35]，肝癌細胞[36]、膽管癌細胞[37]中的 P-gp 表達。EP 在腫瘤治療領(lǐng)域的光明前景，本實驗室聯(lián)合中科學(xué)生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地，以天然單體化合物 CEP 其水溶性和療效，研制出半合成化合物鹽酸千金藤堿de，CH），其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下圖所示。

表 1.1 MTT 法檢測不同濃度的 CH 對卵巢癌 A2780 細胞的抑制率le 1.1 The inhibition rate of A2780 treated with different concentration of CH bayConcentration of CH (μM) Inhibitory rate (%)80 96.36±1.3440 79.57±3.4020 49.16±2.5410 29.24±3.665 20.23±0.872.5 15.57±5.061.25 2.71±2.00IC5030.21±1.24 μM驗數(shù)據(jù)用三次重復(fù)實驗的均數(shù)±標準差來表示。ata were expressed as mean ± SD of triplicate experiments.

第一部分 鹽酸千金藤堿對人卵巢癌細胞增殖、侵襲能力的影響及其作用機制Figure 1.1 The curve of the inhibiton of A2780 treated with CH for 72 h. were expressed as mean ± SD of triplicate experiments.為了考察 CH 對 A2780 細胞的增殖抑制和作用時間的關(guān)系，根據(jù)上一步實驗結(jié)果，我們選取接近 CH 的 IC50濃度 30 μM，進一步檢測加入 CH 后持作用不同時間（24、48、72 和 96h）對 A2780 細胞的增殖抑制。結(jié)果如圖所示，不同組間對 A2780 細胞的抑制率具有顯著性差異，并且隨著 CH 作用間的延長，對 A2780 細胞的抑制率逐步增大，表明 CH 對 A2780 細胞的抑制用具有時間依賴性。

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