【摘要】：目的:通過復(fù)制大鼠和小鼠重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)模型,探討通里攻下經(jīng)典方劑大承氣湯及其主要成分大黃素對NADPH氧化酶的影響,并從氧化應(yīng)激及炎癥小體的方面研究其抗SAP的作用機制。方法:1.大承氣湯對SAP大鼠NADPH氧化酶的抑制作用:SD大鼠24只,通過胰膽管逆行注射5%�；悄懰徕c法復(fù)制SAP大鼠模型,設(shè)置3組,分別為假手術(shù)組、SAP組、SAP+大承氣湯組(大承氣湯組),每組8只。造模后6h處死各組大鼠,于腹中線開腹,從腹主動脈抽取血液樣本,并收取胰腺組織。ELISA法檢測血液樣本上清中Amy、IL-1、IL-1β和TNF-α水平,以及胰腺組織勻漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA、GSH-PX水平;大鼠胰腺組織切片后,HE染色并進行相應(yīng)的病理評分;Western blot及免疫組織化學(xué)法檢測NLRP3、NADPH oxidase 2(NOX2)及NOX的主要結(jié)構(gòu)亞型P22和P47蛋白在胰腺組織中的表達水平。2.大黃素通過抑制NADPH氧化酶治療SAP小鼠的實驗研究:在雨蛙素+LPS誘導(dǎo)小鼠SAP模型基礎(chǔ)上,設(shè)置對照組、SAP組、SAP+大承氣湯組(大承氣湯組)、SAP+大黃素組(大黃素組)及SAP+DPI組(DPI組,DPI為NADPH氧化酶抑制劑),每組8只,各組小鼠于造模后12h處死,小鼠眼眶取血,并取胰腺組織。應(yīng)用ELISA試劑盒檢測血清中Amy、IL-1、IL-1β和TNF-α水平,試劑盒檢測胰腺組織勻漿后氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD,MDA,GSH-PX的水平;小鼠胰腺組織切片后進行HE染色并病理評分;Western blot及免疫組織化學(xué)法檢測胰腺組織NLRP3、NOX2、P22和P47等蛋白的表達情況。結(jié)果:1.大承氣湯對SAP大鼠NADPH氧化酶的抑制作用:相較假手術(shù)組,SAP組大鼠血清指標(biāo)Amy、IL-1、IL-1β和TNF-α水平顯著升高;胰腺氧化應(yīng)激指標(biāo)中,SAP組MDA水平明顯升高,而SOD、GSH-PX水平明顯降低;大承氣湯可以顯著降低SAP組升高的MDA,升高SAP組降低的SOD、GSH-PX水平(P0.05)。HE結(jié)果提示:SAP組胰腺組織較假手術(shù)組有明顯的出血、壞死和炎性細胞浸潤,大承氣湯可以明顯改善胰腺組織的病理改變,降低SAP胰腺組織的病理評分(P0.05);Western blot法檢測胰腺組織相關(guān)蛋白表達,結(jié)果顯示:SAP組大鼠胰腺NLRP3、NOX2、P22和P47蛋白水平較假手術(shù)組顯著升高(P0.05),大承氣湯可顯著下調(diào)SAP的上述指標(biāo)(P0.05),免疫組化結(jié)果也同樣檢測到SAP組目標(biāo)蛋白陽性表達水平的升高以及大承氣湯對其的抑制作用(P0.05)。2.大黃素通過抑制NADPH氧化酶治療SAP小鼠的實驗研究:與對照組相比,SAP組小鼠血清指標(biāo)Amy、IL-1、IL-1β和TNF-α及胰腺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA數(shù)值顯著升高,SOD、GSH-PX水平下降,大承氣湯組、大黃素組、DPI組較SAP組Amy、IL-1、IL-1β、TNF-α和MDA水平降低(P0.05),SOD、GSH-PX水平明顯升高(P0.05);HE結(jié)果顯示:SAP組胰腺組織較對照組有明顯的炎癥和壞死性改變,大承氣湯組、大黃素組、DPI組胰腺病理變化均較SAP組有所改善,病理評分顯著降低(P0.05);Western blot法檢測小鼠胰腺組織NLRP3、NOX2、P22和P47蛋白,SAP組水平均較對照組顯著升高(P0.05),大承氣湯組、大黃素組、DPI組SAP組的上述數(shù)據(jù)有所下降(P0.05);大承氣湯組、大黃素組,DPI組三組蛋白表達水平差異不大(P0.05);免疫組化實驗也進一步證實了與western blot結(jié)果趨勢一致的蛋白表達水平的改變。結(jié)論:1.大承氣湯可以降低SAP大鼠胰腺NADPH氧化酶的表達以及氧化應(yīng)激的水平,降低SAP大鼠炎癥因子,減輕胰腺損傷。2.大承氣湯及其主要成分大黃素可以通過抑制NADPH酶的表達,降低機體炎癥因子及炎癥小體NLRP3的表達水平,進而改善SAP。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

22圖 1：血清 TNF-α、淀粉酶、IL-1 及 IL-1β 水平Fig 1: TNF-α, amylase, IL-1 and IL-1β levelsA：血清 TNF-α 水平（ng/ml） B：血清 AMY 水平（U/L）C：血清 IL-1 水平（pg/L）D：血清 IL-1β 水平（pg/ml）；與假手術(shù)組即 Ctrl 組比較▲▲P<0.01; 與 SAP 組比較△P <0.052.2 胰腺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測SAP 組氧化應(yīng)激水平較假手術(shù)組升高（MDA 升高，SOD 和 GSH-PX 下降，（P<0.01），DCQT 組大鼠胰腺組織氧化應(yīng)激相關(guān)的指標(biāo) SOD、GSH-PX 較 SAP 組升高（P<0.05），而 MDA 下降（P<0.01），表明 DCQT 可以有效降低 SAP 大鼠的氧化應(yīng)激水平（圖 2）。

圖 2：胰腺勻漿 MDA、SOD、GSH-PX 水平Fig 2: SOD, GSH-PX, MDAlevels in rat pancreatic tissueA：胰腺組織 MDA 水平（nmol/mg）B：胰腺組織 SOD 水平(U/mg)C：胰腺組織中的 GSH-PX 水平(U/mg)與 Ctrl 組比較▲▲P <0.01;與 SAP 組比較△P <0.05，△△P <0.012.3 大鼠胰腺組織病理改變顯微鏡下觀測可見假手術(shù)組大鼠胰腺結(jié)構(gòu)較為完整，沒有炎性細胞浸潤；SAP組大鼠腺泡完整度不在，伴大量炎性細胞浸潤，周圍出血，并可見大片狀壞死；DCQT 組較 SAP 組胰腺病理變化明顯改善。HE 組織切片結(jié)果表明 DCQT 應(yīng)用后表現(xiàn)出對胰腺組織的保護作用（圖 3）。

圖 3：大鼠胰腺組織病理改變（HE×200）Fig 3: Pathological changes in rat pancreas（HE×200）A：Ctrl 組胰腺 HE 切片 B：SAP 組胰腺 HE 切片 C：SAP + DCQT 組胰腺 HE 切片 D：胰腺水腫評分 E：胰腺組織的壞死評分 F：胰腺組織的出血評分 G：胰腺組織炎癥評分 H：胰腺組織病理學(xué)總分；與 Ctrl 組比較▲▲P <0.01;與 SAP 組相比△P <0.05，△△P<0.012.4 胰腺組織蛋白 Westernblot 檢測結(jié)果為了探究 DCQT 對 SAP 大鼠 NADPH 氧化酶相關(guān)蛋白表達水平的影響，我們檢測了胰腺組織 NLRP3、NOX2、P22、P47 蛋白的表達，結(jié)果表明，SAP 組胰腺組織 NLRP3、NOX2、p47 和 p22 蛋白表達明顯高于 SAP 組（P<0.01），應(yīng)用 DCQT可降低了 SAP 大鼠上述相關(guān)蛋白水平的表達（P<0.05）（圖 4）。

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本文編號：2781271