【摘要】：背景脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)是臨床常見疾患,致殘率高,遠期缺乏有效治療的藥物。本課題基于多年珍寶丸臨床治療經(jīng)驗及前期實驗研究發(fā)現(xiàn),含珍珠層,蟾蜍,麝香,羚羊的珍寶丸對脊髓損傷(SCI)有良好的治療作用。然而,其修復脊髓損傷的復雜機制尚不清楚,脊髓損傷中各種復雜的分子機制還不是十分明確,還需要進一步的探討及研究,本文從珍寶丸入手,使用脊髓損傷的大鼠模型進行研究,以期得到珍寶丸在脊髓損傷再生修復中的作用和相關(guān)機制。第一部分珍寶丸通過上調(diào)HSP27減少Treg細胞緩解大鼠脊髓損傷目的本研究旨在探討CD4 + CD25 + Foxp3 +調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)在珍寶丸修復脊髓損傷作用機制中的作用,進一步探討Tregs與HSP27在修復機制中的關(guān)系。方法用珍寶丸不同濃度(0,0.5,2.5,5,10mg/mL)處理人外周血單個核細胞(PBMCs),流式細胞儀檢測Tregs中特異性因子CD4 + CD25 + Foxp3 +的表達,用ELISA測定檢測Tregs相關(guān)調(diào)節(jié)因子TGF-β含量。熒光素酶法檢測miR-214與HSP27的關(guān)系,qR-PCR法檢測miR-214的表達水平。qPCR和Western blotting檢測HSP27的表達。采用RNA干擾技術(shù)和基因重組技術(shù)抑制和上調(diào)HSP27的表達。結(jié)果珍寶丸對Tregs的IC50為11.61mg/mL,可顯著抑制人PBMCs分化成Tregs,并上調(diào)超過1倍的HSP27表達。基本上,它通過抑制miR-214表達(50%)來增強HSP27的表達。在人PBMCs中促進了 HSP27表達的抑制,隨后分化成Tregs。當HSP27表達上調(diào)時,向Tregs的分化減少30%。這表明HSP27的表達調(diào)節(jié)了向Tregs的分化。抑制HSP27表達和珍寶丸治療后,分化成Tregs的比例下降,但仍高于僅用藥治療組。在珍寶丸的作用下,HSP27的表達沒有完全干擾,其表達水平仍然增加。結(jié)論在脊髓損傷再生修復的過程中,珍寶丸通過誘導HSP27表達來抑制Treg細胞數(shù)量和降低TGF-β的水平。第二部分珍寶丸通過調(diào)節(jié)GPR17表達的miR-146a-5p防止急性脊髓損傷目的本研究旨在觀察珍寶丸對急性脊髓損傷(ASCI)大鼠運動功能的影響,以及miR-146a-5p和G蛋白偶聯(lián)受體17(GPR17)的分子機制。方法用Allen's法建立急性脊髓損傷的大鼠模型,將大鼠分為3組。將SH-SY5Y細胞在低氧條件下培養(yǎng)過夜并用miR-146a-5p模擬物或miR-146a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染。用(Basso,Beattie,Bresnahan,BBB)評分系統(tǒng)評估大鼠的后肢運動功能。實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)和 Western blot 檢測 miR-146a-5p,GPR17,誘導型一氧化氮合酶(iNOS),白細胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)。使用低細胞計數(shù)測定法測量神經(jīng)元凋亡。進行螢光素酶報告基因測定以確定miR-146a-5p 對 GPR17 的調(diào)節(jié)。結(jié)果珍寶丸可增加miR-146a-5p的表達水平,降低GPR17的表達,生物信息學軟件預測GPR17 3'-UTR與miR-146a-5p具有結(jié)合位點。熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示,miR-146a-5p對GPR17表達具有負調(diào)控作用。降低miR-146a-5p可逆轉(zhuǎn)珍寶丸對缺氧誘導的GPR17上調(diào)的作用,逆轉(zhuǎn)珍寶丸對缺氧誘導的細胞凋亡的抑制作用及增強珍寶丸對ASCI大鼠后肢運動功能的恢復。因此,珍寶丸能增強后肢運動功能,減輕急性脊髓損傷引起的炎癥反應。結(jié)論珍寶丸可通過調(diào)節(jié)miR-146a-5p/GPR17表達來抑制神經(jīng)細胞凋亡,進而促進脊髓功能恢復。
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

根據(jù)預先建立的模型描述協(xié)議［５６］建立了邋ＳＣＩ模型。ＳＣＩ組大水合三氯乙醛（３ｍＬ／ｋｇ）腹部注射麻醉，俯臥位固定，胸背部剃毛備消毒，定位于Ｔ１０棘突位置，以此為中心作為背部正中切口，切開暴脊椎，在Ｔ］０棘突處進行２０ｓ脊椎擠壓至脊髓損傷，縫合傷口，術(shù)后肢癱瘓，表明建模成功（圖１Ａ－Ｆ）。正常組大鼠利用相同方法暴露脊

１．３分組逡逑治療ＳＣＩ大鼠隨機分為４組：對照組（ｎ＝１０）；珍寶丸０．２，邋０．４和０．８邋ｇ／ｋｇ逡逑組（ｎ＝１０），珍寶丸組大鼠口服珍寶丸（圖２），每日１次，每日一次，共６周；逡逑對照組（ｎ＝１０）大鼠口服用賦形劑（０．５％羧甲基纖維素鈉）給藥。逡逑圖２給藥過程逡逑１．４神經(jīng)評估逡逑每周使用珍寶丸治療，使用（ｔｈｅ邋Ｂａｓｓｏ，邋Ｂｅａｔｔｉｅ邋ａｎｄ邋Ｂｒｅｓｎａｈａｎ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ逡逑ｓｃａｌｅ，ＢＢＢ）運動動能評分評估雙后肢運動功能［５７］。如前所述［５８］，傳感器電機逡逑柵格步行測試旨在檢查大鼠精確控制后爪放置的功能。在ＢＢＢ測試中至少步態(tài)逡逑良好的大鼠不能進行人行道，并根據(jù)最大值進行分類。為了減少平均誤差和提高逡逑準確性，所有的評估都采用雙盲技術(shù)進行：兩個人從不同的側(cè)面觀察，并獨立記逡逑錄得分，然后獲得平均值。逡逑１．５細胞培養(yǎng)逡逑如前所述［５９］，從健康受試者的供體人血中制備人ＰＢＭＣ，并將分離的人逡逑ＰＢＭＣ儲存在氮罐中。我們從氮罐中取出人類ＰＢＭＣ，并在３７°Ｃ迅速融化不超逡逑過１分鐘。在無菌條件下

逡逑０．４或０．８邋ｇ邋／邋ｋｇ）處理組大鼠的腳步誤差顯著低于ＳＣＩ對照組（圖３Ｂ）。ＳＣＩ逡逑后大鼠Ｔｒｅｇｓ百分比明顯高于正常組。與ＳＣＩ對照組相比，Ｔｒｅｇｓ珍寶丸的百分逡逑比（０．２，邋０．４或０．８邋ｇ／ｋｇ）治療組均有不同程度的下降。珍寶丸劑量在０．２－０．８邋ｇ逡逑／ｋｇ范圍內(nèi)，Ｔｒｅｇｓ百分比與濃度呈負相關(guān)（圖３Ｃ）。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑２０－ｎ邐８０－逡逑ＣＯ／７邐一逡逑？邐－＊？邋０．２＾邋ｇ邋％逡逑Ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｊｕｒｙ邐＾邐＾邐＾逡逑６邋ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋Ｚｈｅｎｂａｏ邋ｐｉｌｌ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ逡逑＊＊逡逑Ｃ邐一逡逑＊逡逑１５－ｊ邐逡逑＿邋ｓ逡逑Ｉｆｔｌｌｕ逡逑６邋ｗｅｅｋｓ邋ａｆｔｅｒ邋Ｚｈｅｎｂａｏ邋ｐｉｌｌ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ逡逑圖３用不同劑量珍寶丸治療ＳＣＩ大鼠后，評估神經(jīng)功能。逡逑Ａ．

【參考文獻】

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本文編號：2781270