【摘要】：目的:本研究從自噬角度探索通心絡(luò)對心肌細胞的保護機制,并篩選潛在的目標microRNA,以期為臨床治療提供新的藥物靶點。方法:實驗一 105只Sprague-Dawley(SD)雄性成年大鼠造模滿70只后隨機分為7組:假手術(shù)組、模型組、通心絡(luò)低劑量組(0.5g/kg/d)、通心絡(luò)高劑量組(1g/kg/d)、陽性藥阿托伐他汀組(7.2mg/kg/d)、氯喹(10mg/kg/d)組、通心絡(luò)高劑量+氯喹(10mg/kg/d)組,每組10只大鼠。通過預(yù)給藥7天后進行冠狀動脈左前降支結(jié)扎50min再灌注4h制備心肌缺血再灌注損傷動物模型(假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎),通過檢測心電圖、心肌梗死面積、心肌細胞凋亡指數(shù)、心肌酶學(xué)指標等判定通心絡(luò)對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用。通過透射電鏡觀察缺血區(qū)心肌組織的微血管內(nèi)皮形態(tài)和自噬體并通過Western blot檢測自噬蛋白LC3、p62、Beclin1以及線粒體自噬蛋白PINK1、Parkin和泛素蛋白Ubiquitin等判定通心絡(luò)對自噬的干預(yù)效果和線粒體自噬途徑。實驗二 運用microRNA芯片技術(shù)對實驗一大鼠模型組和通心絡(luò)高劑量組進行篩選microRNA的表達變化,并通過qPCR技術(shù)驗證差異表達的microRNA。通過microRNA mimics過表達轉(zhuǎn)染大鼠H9c2心肌細胞,在細胞水平通過缺氧4h/復(fù)氧4h模擬在體缺血再灌注損傷模型,運用CCK8、LDH、流式細胞儀等方法檢測過表達目的microRNA對心肌細胞的表型作用;運用激光共聚焦顯微鏡檢測對心肌細胞自噬流的影響,通過生物信息學(xué)方法結(jié)合已報道文獻預(yù)測目的microRNA的靶基因。結(jié)果:實驗一1.大鼠心肌缺血再灌注損傷模型組造模成功,各組大鼠在結(jié)扎后心電圖均有明顯ST段改變,且伴隨心率加快;再灌注后ST段稍有變化,可伴有T波倒置等表現(xiàn);再灌注4h后各組大鼠心電圖ST段均有不同程度回落。2.假手術(shù)組未見心肌梗死和明顯的心肌細胞凋亡,心肌酶cTnI表達正常。模型組具有明顯的心肌梗死區(qū)域且梗死面積與假手術(shù)組相比有明顯差異(P0.01),心肌細胞的凋亡指數(shù)明顯上升(P0.01),心肌酶cTnI表達升高(P0.01);通心絡(luò)高劑量組與模型組相比,心肌梗死面積明顯減少(P0.05),心肌凋亡指數(shù)和心肌酶cTnI表達降低,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);阿托伐他汀組與模型組相比,心肌梗死面積、心肌凋亡指數(shù)和心肌酶cTnI表達具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),且效果與通心絡(luò)高劑量組相當;氯喹組與模型組相比,心肌梗死面積、心肌凋亡指數(shù)和心肌酶cTnI表達明顯增加(P0.05),通心絡(luò)高劑量+氯喹組與通心絡(luò)高劑量組相比,心肌梗死面積和心肌凋亡指數(shù)均明顯增加(P0.05),心肌酶cTnI表達升高(P0.05)。3.假手術(shù)組心肌細胞微觀結(jié)構(gòu)未見有明顯異常;模型組和假手術(shù)組相比,心肌細胞和心肌微血管內(nèi)皮細胞微觀結(jié)構(gòu)紊亂,線粒體腫脹、分裂,線粒體內(nèi)外膜間隙增寬,自噬體較多而明顯(P0.05);通心絡(luò)高劑量組和阿托伐他汀組與模型組相比,均能改善心肌細胞線粒體結(jié)構(gòu)和心肌微血管內(nèi)皮細胞微觀結(jié)構(gòu),且自噬體數(shù)量較多(P0.05);氯喹組與模型組相比,心肌細胞微觀結(jié)構(gòu)明顯混亂,線粒體崩解、分裂;通心絡(luò)高劑量+氯喹組與通心絡(luò)高劑量組相比,心肌細胞微觀結(jié)構(gòu)未見明顯改變。4.假手術(shù)組的自噬蛋白LC3、p62、Beclin1表達水平較低,與之相比,模型組的自噬蛋白LC3、p62表達明顯升高(P0.05),Beclin1蛋白表達上調(diào),沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);通心絡(luò)能夠劑量依賴性地增加LC3(P0.05)、p62(P0.05)、Beclin1(P0.05)蛋白表達水平,其效果與阿托伐他汀相當。而氯喹組與模型組相比,自噬蛋白明顯下調(diào)(其中Beclin1(P0.05)),通心絡(luò)高劑量+氯喹組與通心絡(luò)高劑量組相比,LC3、p62、Beclin1表達均有下降,但無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。5.假手術(shù)組的PINK1、Parkin蛋白和Ubiquitin蛋白均有少量表達,模型組與假手術(shù)組相比,三者均具有較明顯升高(P0.05);與模型組相比,通心絡(luò)高、低劑量組均能增加PINK1、Parkin蛋白表達(P0.05),而減少Ubiquitin蛋白(P0.05),其中通心絡(luò)高劑量組和阿托伐他汀均能使PINK1、Parkin蛋白相較于模型組有明顯升高(P0.05),Ubiquitin蛋白則無明顯差異(P0.05)。6.VEGF在模型組中比假手術(shù)組表達明顯增多(P0.05),通心絡(luò)高劑量組與模型組相比,其表達量明顯升高(P0.05);阿托伐他汀組則與模型組相比沒有明顯升高(P0.05)。實驗二1.通過microRNA芯片篩選和qPCR驗證,miR-450a-5p,miR-532-5p,miR-193a-3p在通心絡(luò)高劑量組相較于模型組具有明顯上調(diào)(P0.05),且表達趨勢與芯片一致。2.大鼠H9c2心肌細胞缺氧4h/復(fù)氧4h能夠引起明顯的細胞活力減弱(P0.05),LDH釋放增加(P0.05),流式凋亡增加(PP0.05),而轉(zhuǎn)染miR-450a-5p,miR-532-5p,miR-193a-3p均能增加細胞活力,減少LDH釋放和凋亡,具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。3.轉(zhuǎn)染miR-450a-5p,miR-532-5p mimics能夠增加其表達量,提升細胞內(nèi)的自噬流水平(P0.05)。4.結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測和既往文獻報道推測miR-532-5p,miR-450a-5p均與心肌缺血缺氧有關(guān),其中PDCD4、TP53可能是通心絡(luò)通過miR-532-5p或miR-450a-5p保護心肌細胞的靶基因。結(jié)論:1.心肌缺血再灌注損傷模型組造成明顯的心肌損傷,高劑量通心絡(luò)預(yù)給藥能夠緩解心肌缺血再灌注損傷,保護心肌細胞;2.通心絡(luò)緩解心肌缺血再灌注損傷和調(diào)控心肌細胞自噬水平密切相關(guān);3.通心絡(luò)通過PINK1/Parkin線粒體自噬通路清除損傷線粒體,并和泛素蛋白酶體系統(tǒng)協(xié)同處理錯誤折疊蛋白的降解,維持胞內(nèi)平衡,保護心肌細胞;4.miR-450a-5p和miR-532-5p可能是通心絡(luò)保護缺血心肌的靶microRNA,PDCD4、P53可能是通心絡(luò)通過miR-532-5p或miR-450a-5p緩解心肌缺血再灌注損傷的靶基因。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖２各組大鼠心肌梗死和心肌酶學(xué)指標逡逑注：圖（ａ）中白色部分（黑箭頭）為心肌梗死區(qū)域，紅色部分為正常心肌。＊＊為和假手術(shù)組相比具逡逑有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（戶＜0．0１）；邋＃為和模型組相比，具有統(tǒng)計學(xué)差異（／＜0．邋０５）；邋▲▲為和通心絡(luò)逡逑高劑量組相比，具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（／＜0．邋０１）。（Ｓ：假手術(shù)組；Ｍ：缺血再灌注模型組；Ｌ：通心逡逑絡(luò)低劑量組；Ｈ：通心絡(luò)高劑量組；Ａ：阿托伐他汀組；ＣＱ：自噬抑制劑氯喹組；Ｈ＋ＣＱ：通心絡(luò)高劑逡逑量＋氯喹組。）逡逑６４逡逑

具有統(tǒng)計學(xué)差異（／＜0．邋０５）。（Ｓ：假手術(shù)組；Ｍ：缺血再灌注模型組；Ｌ：通心絡(luò)低劑量組；逡逑Ｈ：通心絡(luò)高劑量組；Ａ：阿托伐他汀組；ＣＱ：自噬抑制劑氯喹組；Ｈ＋ＣＱ：通心絡(luò)高劑量＋氯喹組。）逡逑如圖３所示，假手術(shù)組凋亡極少，模型組與之相比，棕色斑點明顯增多，提示ＭＩＲＩ逡逑造成明顯的心肌細胞凋亡。通心絡(luò)和阿托伐他汀預(yù)給藥組明顯降低心肌凋亡指數(shù)，且高逡逑劑量通心絡(luò)組與阿托伐他汀組效果相當。而氯喹組能夠?qū)е旅黠@的心肌細胞凋亡，提示逡逑抑制自噬會造成明顯的心肌細胞凋亡。高劑量通心絡(luò)能夠逆轉(zhuǎn)氯喹的損傷作用，說明通逡逑心絡(luò)高劑量能夠降低氯喹對心肌凋亡的促進作用，從而起到保護心肌的作用。逡逑５．心肌細胞線粒體和自噬體的透射電鏡圖片逡逑６６逡逑

（ａ）邐（ｂ）逡逑圖４透射電鏡圖片與自噬體逡逑上圖中黑色箭頭所示為自噬體。（ａ）自噬溶酶體的經(jīng)典單層膜結(jié)構(gòu)；（ｂ）包裹疑似未折疊體。＊為和假手術(shù)組相比具有統(tǒng)計學(xué)差異（戶＜０．０５）：邋＃為和模型組相比，具有統(tǒng)計學(xué)０．０５）；邋▲為和通心絡(luò)高劑量組相比，具有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（戶＜０．邋０５）。逡逑手術(shù)組；Ｍ：缺血再灌注模型組；Ｌ：通心絡(luò)低劑量組；Ｈ：通心絡(luò)高劑量組；Ａ：阿托ＣＱ：自噬抑制劑氯喹組；Ｈ＋ＣＱ：通心絡(luò)高劑量＋氯喹組。）逡逑

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本文編號：2781145