【摘要】：目的:(1)研究NLRP3炎癥小體在自然衰老大鼠認(rèn)知功能衰退中的作用。(2)從NLRP3炎癥小體途徑探討竹節(jié)參總皂苷(Saponins from Panax japonicus,SPJ)對自然衰老大鼠認(rèn)知功能衰退改善的作用機(jī)制方法:實(shí)驗(yàn)一:分別取不同年齡階段的SD雄性大鼠,即青年組(Adult,6M)、中年組(Middle,12M)、老年組(Aged,24M),每組12只,采用曠場、新物體認(rèn)知和Morris水迷宮方法檢測各組大鼠認(rèn)知功能的變化,場電位記錄法檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸傳遞長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation,LTP)的變化,高爾基染色檢測各組大鼠海馬樹突棘的變化。Western blot法檢測各組大鼠NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NOD樣受體3(NOD-Like receptors 3,NLRP3)、接頭蛋白即凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)和效應(yīng)分子半胱氨酸蛋白酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)的表達(dá)變化以及突觸可塑性相關(guān)蛋白N-甲基-D-天門冬氨酸受體亞型2A(N-Methyl-D-Aspartate receptor subunit 2A,NMDAR2A)、N-甲基-D-天門冬氨酸受體亞型2B(N-Methyl-D-Aspartate receptor subunit 2B,NMDAR2B)、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑受體亞單位1(α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazole proprionic acid receptor subunit 1,GluA1)、α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑受體亞單位2(α-amino-3-hydroxy-5-methy-4-isoxazole proprionic acid receptor subunit 2,GluA2)和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CAMP-response element binding protein,CREB),鈣調(diào)蛋白激酶II(Calmodulin-dependent protein kinase II,CAMKII)及其磷酸化表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)二:將24月齡SD雄性大鼠隨機(jī)分為老年對照組(Aged,24M)和NLRP3炎癥小體抑制劑組(AC-YVAD-CMK),每組10只。另取10只大鼠作為青年對照組(Adult,6M),側(cè)腦室埋管給藥,抑制劑組給予對應(yīng)的NLRP3炎癥小體抑制劑(AC-YVAD-CMK),老年對照組與青年對照組分別給予等量的腦脊液,每天給藥一次,連續(xù)給藥三周。采用曠場、新物體認(rèn)知和Morris水迷宮方法檢測各組大鼠認(rèn)知功能的變化,場電位記錄法檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸傳遞長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的變化。Western blot法檢測各組大鼠NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá)變化以及突觸可塑性相關(guān)蛋白GluA1、GluA2和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白CAMKII、CREB及其磷酸化表達(dá)的變化。實(shí)驗(yàn)三:將18月齡的SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組,即自然衰老組及竹節(jié)參總皂苷10mg/kg和30 mg/kg劑量組,每組10只。給藥組大鼠從18月齡開始分別灌胃給予10mg/kg和30 mg/kg的竹節(jié)參總皂苷,自然衰老組大鼠給予等量的生理鹽水,灌胃至24月齡。每周連續(xù)灌胃6 d,停藥1 d,另取10只6月齡的大鼠作為青年對照組。曠場、新物體認(rèn)知和Morris水迷宮方法檢測各組大鼠認(rèn)知功能的改變,場電位記錄法檢測各組大鼠海馬CA1區(qū)突觸傳遞長時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的變化。Western blot法檢測各組大鼠NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá)變化以及突觸可塑性相關(guān)蛋白GluA1、GluA2和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白CAMKII、CREB及其磷酸化表達(dá)的變化。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:新物體認(rèn)知和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與青年對照組相比,衰老組大鼠認(rèn)知功能顯著降低(P0.05)。場電位記錄結(jié)果顯示,大鼠海馬CA1區(qū)LTP損害年齡依賴性升高(P0.05)。高爾基染色結(jié)果表明,隨著年齡增長,大鼠海馬樹突棘密度減少,衰老組較青年組有顯著差異(P0.05)。Western blot結(jié)果顯示,NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá)水平年齡依賴性升高,而突觸可塑性相關(guān)蛋白NMDAR2A、NMDAR2B、GluA1、GluA2和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白p-CAMKII、p-CREB表達(dá)年齡依賴性顯著降低(P0.05或P0.01)。實(shí)驗(yàn)二:給與NLRP3炎癥小體抑制劑后,結(jié)果顯示,抑制劑可改善衰老組大鼠的認(rèn)知功能衰退,減輕衰老組大鼠海馬CA1區(qū)LTP的受損程度。同時(shí),Western blot結(jié)果顯示,給與NLRP3炎癥小體抑制劑后可降低衰老大鼠NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的蛋白表達(dá)水平,升高突觸可塑性相關(guān)蛋白NMDAR2A、NMDAR2B、GluA1、GluA2和學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白p-CAMKII、p-CREB的表達(dá)水平(P0.05或P0.01)。實(shí)驗(yàn)三:給予衰老大鼠竹節(jié)參總皂苷干預(yù)后,行為學(xué)結(jié)果表明,竹節(jié)參總皂苷可改善衰老大鼠的認(rèn)知功能衰退。LTP結(jié)果也表明,竹節(jié)參總皂苷可減輕衰老大鼠海馬CA1區(qū)LTP的受損程度。Western blot結(jié)果顯示,竹節(jié)參總皂苷可降低衰老大鼠NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá)水平;同時(shí),竹節(jié)參總皂苷可增強(qiáng)突觸可塑性相關(guān)蛋白AMPA受體亞型GluA1和GluA2的膜表達(dá),增強(qiáng)衰老大鼠學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白CAMKII、CREB的磷酸化表達(dá)水平(P0.05或P0.01)。結(jié)論:(1)NLRP3炎癥小體在自然衰老大鼠認(rèn)知功能衰退中起重要作用,抑制NLRP3炎癥小體激活可改善衰老大鼠認(rèn)知功能減退。(2)竹節(jié)參總皂苷可改善自然衰老大鼠認(rèn)知功能衰退,其機(jī)制可能與其調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體,進(jìn)而調(diào)節(jié)AMPA受體(GluA1和GluA2)膜表達(dá),增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶相關(guān)蛋白CAMKII和CREB的磷酸化表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：三峽大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

三 峽 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文注：曠場實(shí)驗(yàn)（A，B），圖 A 代表各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)運(yùn)動總路程，圖 B 代表各組大鼠曠場實(shí)驗(yàn)中央?yún)^(qū)時(shí)間占比；新物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)（C），圖 C 代表各組大鼠新物體認(rèn)知實(shí)驗(yàn)識別系數(shù)；Morris 水迷宮（D-I），D 表示各組大鼠的潛伏期；E 表示各組大鼠的運(yùn)動路程；F 表示各組大鼠的平均速度；G 表示各組大鼠通過平臺的次數(shù)；H 表示各組大鼠停留在各個象限的時(shí)間；I 表示各組大鼠的運(yùn)動軌跡。Adult：青年組（6M），Middle：中年組（12M），Aged：老年組（24M）。值表示均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，與青年組相比，*P<0.05，**P<0.01，n=122 自然衰老大鼠海馬區(qū)樹突棘的變化高爾基染色結(jié)果表明，隨著年齡的增長大鼠神經(jīng)元樹突的二級分支和末梢分支均在減少，且自然衰老大鼠較青年大鼠有顯著性差異（P<0.05，圖 A-D）。

三 峽 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文老年組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元樹突棘二級分支；圖 B 代表各組大鼠神經(jīng)元樹突棘二級分支統(tǒng)計(jì)圖；圖C 代表各組大鼠神經(jīng)元樹突棘末梢分支示意圖，a，b，c 別代表青年組大鼠、中年組大鼠、老年組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元樹突棘末梢分支；圖 D代表各組大鼠神經(jīng)元樹突棘末梢分支示統(tǒng)計(jì)圖。Adult：青年組（6M），Middle：中年組（12M），Aged：老年組（24M）。值表示均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，與青年組相比，*P<0.053 自然衰老大鼠海馬區(qū) LTP 的變化LTP 結(jié)果表明青年組大鼠 LTP 為 142.8 ±7.4%，中年組大鼠 LTP 為 130.2 ±4.4%，老年組大鼠 LTP 為 110.3± 5.3%，且老年組大鼠 LTP 較青年組大鼠 LTP 有顯著下降（P<0.05，圖 A-B）。

圖 4 自然衰老大鼠 NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達(dá)的變化注：圖 A 代表各組大鼠 NLRP3、ASC、Caspase-1 的免疫條帶；圖 B 代表海馬區(qū) NLRP3 光密度相對值；圖 C 代表海馬區(qū) ASC 光密度相對值；圖 D 代表海馬區(qū) Caspase-1 光密度相對值。Adult：青年組（6M），Middle：中年組（12M），Aged：老年組（24M）。值表示均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤，與青年組相比，*P<0.05，**P<0.01，n=45 自然衰老大鼠 NMDA 受體功能的變化結(jié)果表明青年組大鼠 NMDAR-fEPSP 為 69.7 ±2.8%，中年組大鼠 NMDAR-fEPSP為51.6 ±3.4%，老年組大鼠NMDAR-fEPSP為39.7±2.3%，老年組大鼠NMDAR-fEPSP較青年組大鼠顯著下降（P<0.05，圖 A-C）。隨著年齡的增長，大鼠 NMDAR-LTP 在下降，其下降的原因可能源于突觸前遞質(zhì)釋放增加，也可能源于突觸后受體的反應(yīng)性增強(qiáng)。輸入輸出曲線則反應(yīng)了突觸后受體情況，輸入輸出曲線結(jié)果表明隨著年齡增加，大鼠突觸后受體減少，老年組大鼠較青年組大鼠相比，有顯著性的下降（P<0.05，圖D）。以上結(jié)果表明，隨著年齡的增長，大鼠海馬區(qū) NMDAR-LTP 下降的原因可能與突觸后受體功能下降有關(guān)，而與突觸前遞質(zhì)釋放無關(guān)。隨著年齡的增長，大鼠腦內(nèi)NMDA 受體功能受損增加。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2778836