【摘要】：前言:酒精性心肌病(Alcoholic cardiomyopathy)是指長期大量酒精攝入導致的以心臟擴大、心律失常和充血性心力衰竭為特征的心肌病。酒精性心肌病目前已經(jīng)成為現(xiàn)代心血管領(lǐng)域中的常見疾病,其患病率及患病人口在發(fā)達國家和發(fā)展中國家中逐年上升,它嚴重威脅到人類的健康,并耗費巨額衛(wèi)生資源。在酒精性心肌病的發(fā)病機制中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與能量代謝成為近幾年研究的熱點。酒精誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導胰島素信號傳導障礙,這些誘導的損傷變化使心肌細胞能量代謝發(fā)生障礙,導致心臟功能不全,心功能降低,造成酒精性心肌病。因此,探索有效的藥物防治酒精誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷,抑制心肌細胞胰島素信號傳導通路障礙,改善心功能有著重要的臨床意義。姜黃素(C_(21)H_(20)O_6)是從中藥姜黃的根中提取的一種多酚化合物,藥理學性質(zhì)有抗氧化性、抗癌、抗血管生成、抗增殖和抗炎等作用。近年有報道在很多體內(nèi)和體外實驗中,姜黃素可以起到激活胰島素信號途徑的作用,也可作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激拮抗劑,發(fā)揮緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用。已有文獻報道姜黃素在酒精性肝病中存在抑制脂肪細胞變性的作用。我們以此為出發(fā)點去研究酒精性心肌病中,姜黃素能否通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進而緩解胰島素抵抗,進而解除心肌細胞糖代謝紊亂。目的:本實驗擬采用AC16心肌細胞,建立酒精性心肌病細胞模型,觀察在離體培養(yǎng)心肌細胞中,給予姜黃素是否可以減輕乙醇誘導的心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生及糖代謝紊亂。材料與方法:1、以AC16細胞作為研究對象,設(shè)立正常對照組(不加任何干預)、對照組(insulin)、乙醇(400mmol/l)組、姜黃素(50umol/l)+乙醇組(400mmol/l)、4-PBA+乙醇組(400mmol/l)。濃度根據(jù)已有文獻和預實驗確定。2、采用MTS法檢測不同濃度乙醇對心肌細胞存活率的影響以及選取最適乙醇和姜黃素濃度用于后續(xù)實驗。3、應(yīng)用RT-PCR方法檢測各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達量的變化。4、應(yīng)用Western blot方法檢測各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)因子GRP78、IRE1和胰島素信號通路相關(guān)因子IRS-1、AKT、p-IRS、p-AKT蛋白表達變化。5、用透射電鏡觀察各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激超微結(jié)構(gòu)變化。6、用葡萄糖氧化酶法檢測各組葡萄糖消耗情況。7、各實驗組數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(_?x±s)表示,利用IBM SPSS 21.0分析,兩組間數(shù)據(jù)差異比較采用單因素方差分析。P0.05為存在顯著性統(tǒng)計學差異。結(jié)果:1、細胞存活率乙醇以濃度依賴的方式導致細胞的存活率下降,且濃度為400mmol/l時細胞存活率下降最為明顯,故后續(xù)實驗以400mmol/l為損傷條件。不同濃度姜黃素(0、5、10、20、50、100umol/l)處理細胞48小時對細胞生存率無明顯影響。姜黃素以濃度依賴的方式提高乙醇誘導細胞的存活率,姜黃素濃度達50umol/l時細胞生存率明顯提高,故以50umol/l來研究姜黃素的保護作用。2、乙醇組較對照組GRP78 mRNA、IRE1 mRNA表達量明顯增加,差異具有顯著性;姜黃素和4-PBA預處理后,GRP78 mRNA、IRE1 mRNA表達有所降低,與乙醇組比較差異具有顯著性。3、透射電鏡觀察對照組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)明顯異常,乙醇組可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)異常,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹,內(nèi)部充滿未折疊蛋白,腫脹的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增加,姜黃素和4-PBA與處理組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)異常程度較乙醇組有所減輕。4、Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、IRE1表達,乙醇組較對照組表達明顯增加,姜黃素和4-PBA預處理組GRP78、IRE1表達較乙醇組降低,差異具有顯著性。P-IRS-1(Thr308)和p-AKT(Thr308)蛋白表達在乙醇組明顯下降,姜黃素和4-PBA組IRS-1(Thr308)和p-AKT(Thr308)較乙醇組表達增加,差異具有差異性。5、葡萄糖消耗量檢測乙醇組在胰島素刺激下葡萄糖消耗量下降顯著,姜黃素和4-PBA預處理組在胰島素刺激下較乙醇組葡萄糖消耗量升高,差異具有顯著性。結(jié)論:乙醇可使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、胰島素抵抗相關(guān)因子表達升高,使糖代謝異常,而姜黃素可發(fā)揮與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激拮抗劑相似的作用,通過緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進而促進糖代謝的恢復,姜黃素為酒精性心肌病在藥物治療方面提供新思路。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

中國醫(yī)科大學碩士學位論文3 結(jié)果濃度乙醇作用下 AC16 細胞存活率檢測 MTS 法測定不同濃度乙醇（0、100、200、300、400、500、60 細胞存活率的影響，選擇最適宜的乙醇濃度用于后續(xù)實驗。選取率下的乙醇處理濃度，結(jié)果可見當濃度達到 400mmol/l 時細胞存±0.04%（n=3, p＜0.01），故本實驗選取 400mmol/l 濃度乙醇為最適

圖 2 不同濃度姜黃素對細胞存活率的影響不同濃度的姜黃素作用于 AC16 細胞：0、5、10、20、50、100(umo細胞存活率，數(shù)值以百分比表示( x±s)。濃度姜黃素和乙醇作用下細胞存活率檢測 細胞在 400mmol/l 的乙醇作用下存活率下降明顯，故選取此黃素在上述濃度梯度的作用下生存率無明顯影響，故用不同后，再用 400mmol/l 的乙醇刺激細胞，當姜黃素濃度在 50um為 83.89±0.02%（n=3，p＜0.05），故選取最適姜黃素濃度為 5。

圖 2 不同濃度姜黃素對細胞存活率的影響同濃度的姜黃素作用于 AC16 細胞：0、5、10、20、50、100(um細胞存活率，數(shù)值以百分比表示( x±s)。度姜黃素和乙醇作用下細胞存活率檢測細胞在 400mmol/l 的乙醇作用下存活率下降明顯，故選取此素在上述濃度梯度的作用下生存率無明顯影響，故用不同后，再用 400mmol/l 的乙醇刺激細胞，當姜黃素濃度在 50u 83.89±0.02%（n=3，p＜0.05），故選取最適姜黃素濃度為 。

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本文編號：2776870