【摘要】：目的:研究葛根素對(duì)小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響以及TRPM3在其中的作用,為臨床應(yīng)用葛根素治療骨質(zhì)疏松以及葛根素在臨床上的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論指導(dǎo)。方法:1.不同濃度(0.1,1,10μM)的葛根素作用于成骨細(xì)胞24,48和72h后,CCK-8法檢測空白對(duì)照組、葛根素組以及陽性對(duì)照雌二醇組細(xì)胞的活性。2.0.1,1,10μM葛根素作用成骨細(xì)胞48h后,流式細(xì)胞術(shù)檢測空白對(duì)照組、葛根素組以及雌二醇組細(xì)胞的細(xì)胞周期。3.堿性磷酸酶(ALP)活性檢測0.1μM葛根素和0.01μM雌二醇作用48h后成骨細(xì)胞分化能力的改變。4.茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色法檢測0.1μM葛根素和0.01μM雌二醇干預(yù)14,21和28d后各組細(xì)胞的礦化能力。5.RT-PCR和Western Blotting檢測0.1 μM葛根素和0.01μM雌二醇作用細(xì)胞48h后,TRPM3mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。6.流式細(xì)胞術(shù)和鈣離子檢測試劑盒分別檢測0.1μM葛根素作用2,24和48h后,細(xì)胞內(nèi)、外鈣離子的濃度。7.轉(zhuǎn)染TRPM3-siRNA、使用TRPM3激動(dòng)劑孕烯醇酮硫酸鹽(pregnenolone sulfate,PS)、TRPM3抑制劑2-氨基乙酯二苯基硼酸(2-aminoethoxydiphenyl borate,2-APB)作用 MC3T3-E1 細(xì)胞后,檢測 Runx2表達(dá)水平以及成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化能力的改變。結(jié)果:1.0.1,1,10μM葛根素能顯著促進(jìn)小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖,使G1期細(xì)胞比例減少,G2+S期細(xì)胞比例增加,其中以0.1μM的濃度作用效果最佳。與空白對(duì)照組相比較,0.1μM葛根素能顯著提高細(xì)胞ALP活性,促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成。2.0.1μM葛根素作用細(xì)胞48h后,TRPM3表達(dá)水平降低,而Runx2的表達(dá)水平升高。3.TRPM3-siRNA和2-APB作用細(xì)胞48h后能夠促進(jìn)Runx2的表達(dá),從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化,而PS則抑制此作用。4.向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度(0.5,5,10,20mM)的鈣離子,分別培養(yǎng)24,36和48h,與空白對(duì)照組相比較,鈣離子組的細(xì)胞活性和ALP活性顯著增強(qiáng)。5.葛根素作用細(xì)胞2h后,細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度增加,細(xì)胞外鈣離子濃度減少;作用24h時(shí),與空白對(duì)照組相比較,葛根素組細(xì)胞內(nèi)、外鈣離子濃度的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。當(dāng)作用時(shí)間延長至48h時(shí),表現(xiàn)為葛根素組細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低,細(xì)胞外鈣離子濃度升高。結(jié)論:葛根素能夠促進(jìn)小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖,分化和礦化,原因可能為:①葛根素通過下調(diào)TRPM3表達(dá)導(dǎo)致Runx2的表達(dá)增強(qiáng),從而促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化;②葛根素短時(shí)間(2h)內(nèi)能使細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度增加,細(xì)胞外鈣離子濃度減少,促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化;長時(shí)間(48h)作用后,TRPM3的表達(dá)量下降,使?jié)B透到細(xì)胞內(nèi)的鈣離子減少,導(dǎo)致細(xì)胞外間隙的鈣離子濃度增加,這可能是為了增加與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的結(jié)合,為礦化做準(zhǔn)備。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

圖１：葛根素對(duì)ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞增殖，分化和礦化的影響逡逑：用不同濃度（０．１，１，１0ｍＭ）的葛根素處理ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞２４，邋４８和７２小時(shí)，逡逑ＣＫ－８法測定評(píng)估細(xì)胞增殖能力。Ｂ：邋０．１邋ｐＭ葛根素處理４８小時(shí)后檢測細(xì)胞的堿逡逑磷酸酶（ＡＬＰ）水平。Ｃ：光學(xué)顯微鏡下礦化結(jié)節(jié)的茜素紅染色（ｘｌＯＯ）。Ｄ：逡逑．ｌ＾ｉＭ葛根素處理細(xì)胞１４，邋２１和２８天后，檢測各組相對(duì)礦化結(jié)節(jié)面積。Ｅ：邋０．１，逡逑

ｍｉＲ－２０４與ＴＲＰＭ３的ｍＲＮＡ共同表達(dá)我們的前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)葛根素能夠逡逑下調(diào)ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞中ｍｉＲ－２０４的表達(dá)，葛根素對(duì)ＴＲＰＭ３表達(dá)的影響也值得進(jìn)一逡逑步探討。如圖２Ａ實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，作用４８ｈ后，與空白對(duì)照組相比較，Ｏ．ｌ＾Ｍ葛根逡逑素組和Ｏ．Ｏｌ＾Ｍ雌激素組細(xì)胞ＴＲＰＭ３邋ｍＲＮＡ表達(dá)水平顯著下降。圖２Ｂ和圖２Ｃ的逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔｔｉｎｇ結(jié)果顯示，葛根素組和雌激素組的ＴＲＰＭ３蛋白表達(dá)量也明顯降逡逑低。結(jié)果表明，葛根素不僅能下調(diào)ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞中ｍｉＲ－２０４的表達(dá)，也能降低逡逑ＴＲＰＭ３的ｍＲＮＡ和蛋白質(zhì)表達(dá)量。逡逑Ａ邐Ｂ逡逑０邐１－５＇逡逑＾邐Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｐｕｅ邋Ｅ２逡逑Ｚ邋“邐｜逡逑１邋１０＊邋￣￣｜邐ＴＲＰＭ３邋邐邐邐邋１９７ＫＤ逡逑§邐－ｊ－逡逑隹邋0．５－邐＊邐（３－ａｃｔｉｎ邐４３ＫＤ逡逑ｏ．ｏ邐￣逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邋Ｐｕｅ邐Ｅ２逡逑Ｃ＿逡逑１邋１．５－，逡逑０逡逑１逡逑２邐ｔｏ－邋ｒ逡逑卜ｉ？逡逑圣邋0．0」邐邐■■■￣■■■Ｌ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ邐Ｐｕｅ邐Ｅ２逡逑圖２：葛根素對(duì)ＴＲＰＭ３表達(dá)的影響逡逑Ａ：邋Ｏ．ｌｐＭ葛根素作用細(xì)胞４８小時(shí)后，ＲＴ－ＰＣＲ法檢測ＴＲＰＭ３邋ｍＲＮＡ的表達(dá)。Ｂ－Ｃ：逡逑０．１｜＿ｉＭ葛根素作用細(xì)胞４８小時(shí)后，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ法檢測ＴＲＰＭ３蛋白的表達(dá)量。逡逑＜０．０５，與空白對(duì)照組相比較。逡逑２．３邋ＴＲＰＭ３抑制ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細(xì)胞Ｒｕｎｘ２的表達(dá)逡逑Ｒｕｎｘ２是一種關(guān)鍵的骨生長調(diào)節(jié)因子，參與了成骨細(xì)胞的X椫澈頭只�。晤U清義锨捌謔笛檠芯糠⑾

本文編號(hào)：2776978