【摘要】：目的:本課題以“祛瘀生新”治療大法為基礎(chǔ),以行氣化瘀扶正為治療原則,以宣痹通瘀方促進(jìn)缺血心肌血管新生為切入點(diǎn),開展實(shí)驗(yàn)研究。以冠脈結(jié)扎制備的心肌缺血大鼠模型為研究對(duì)象,探究宣痹通瘀方對(duì)心肌缺血大鼠模型Notch/Dell4信號(hào)通路及血管新生相關(guān)因子的調(diào)控機(jī)制。明確宣痹通瘀方治療冠心病心肌缺血的作用機(jī)制,豐富冠心病心肌缺血的研究思路,為中藥促進(jìn)血管新生的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.宣痹通瘀方對(duì)心肌缺血大鼠治療作用及機(jī)制探討的在體實(shí)驗(yàn)研究選取健康SD大鼠96只,雌雄各半,220-250g,適應(yīng)喂養(yǎng)1周后,進(jìn)行心肌缺血大鼠模型制備,采用結(jié)扎冠脈前降支血管的方法制備心肌缺血模型,隨機(jī)選取16只大鼠設(shè)置為假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎,造模前后記錄標(biāo)準(zhǔn)II導(dǎo)聯(lián)心電圖,觀測(cè)ST段偏移幅度,以ST段抬高0.2mV定為造模成功。將造模成功的75只大鼠中隨機(jī)分為心肌缺血模型對(duì)照組(n=15),麝香保心丸陽性對(duì)照組(n=15),宣痹通瘀方低中高劑量組各15只(n=45)。分別灌胃給予麝香保心丸24.3mg/(kg·d),宣痹通瘀方低中高劑量組給藥劑量分別為0.8g、1.6g、3.2g/kg·d,缺血模型組與假手術(shù)組分別給予等體積的蒸餾水。藥物干預(yù)時(shí)間為4周。第4周末統(tǒng)計(jì)大鼠死亡率,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血檢測(cè)血清中AST、CK、LD H、cTn、SOD活性、MDA含量。常規(guī)石蠟病理切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)、透射電鏡及免疫組化檢測(cè)VEGF、Notch1的表達(dá);提取心肌組織進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)CD34的表達(dá);提取心肌組織行RT-PCR檢測(cè)VEGF、Notch1、Dell4基因的表達(dá);提取心肌組織行蛋白免疫印跡檢測(cè)VEGF、Notch1、Dell4蛋白的表達(dá)情況。2.宣痹通瘀方對(duì)缺缺氧刺激的HUVEC血管內(nèi)皮細(xì)胞Notch-Dell4通路的影響應(yīng)用HUVEC培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),將血管內(nèi)皮細(xì)胞放置于缺氧培養(yǎng)箱中(95%N2,5%C02)培養(yǎng),分別培養(yǎng)2h、4h、8h。采用CCK8法檢測(cè)缺血缺氧條件不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞的活力影響;根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選用缺血缺氧條件下培養(yǎng)4h的方法,制備HUVEC內(nèi)皮細(xì)胞缺血缺氧模型。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為5組:缺血缺氧模型對(duì)照組:缺血缺氧培養(yǎng)細(xì)胞4h;麝香保心丸陽性對(duì)照組:缺血缺氧培養(yǎng)細(xì)胞4h+10%麝香保心丸含藥血清培養(yǎng)4h;宣痹通瘀低劑量組:缺血缺氧培養(yǎng)細(xì)胞4h+2%宣痹通瘀方含藥血清培養(yǎng)4h;宣痹通瘀中劑量組:缺血缺氧培養(yǎng)細(xì)胞4h+10%宣痹通瘀方含藥血清培養(yǎng)4h;宣痹通瘀高劑量組:缺血缺氧培養(yǎng)細(xì)胞4h+15%宣痹通瘀方含藥血清培養(yǎng)4h;采用RT-PCR法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF、Notch1、Dell4mRNA表達(dá);采用Western blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF、Notch1、Dell4蛋白的表達(dá);對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行Transwell遷移實(shí)驗(yàn);對(duì)各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行管腔形成實(shí)驗(yàn)。結(jié)果1.宣痹通瘀方對(duì)心肌缺血大鼠治療作用及機(jī)制的在體實(shí)驗(yàn)研究1.1在冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后5min、d1、d2、d3、d4、d5、d6和d7,與假手術(shù)組比較缺血模型組大鼠心電圖ST段均明顯抬高(P0.001;P0.01或P0.05)。在給藥第2天至第7天,宣痹通瘀方高劑量組動(dòng)物心電圖ST段上移幅度下降(分別為P0.01或P0.05);在給藥第3天至第6天,與缺血模型組比較,宣痹通瘀方中劑量組動(dòng)物心電圖ST段上移幅度下降(P0.05);在給藥第3天至第5天,與模型組比較,宣痹通瘀方低劑量組動(dòng)物心電圖ST段上移幅度明顯下降(P0.05)。在給藥后第2天至第5天,與模型組比較,陽性對(duì)照藥麝香保心丸組動(dòng)物心電圖ST段上移幅度明顯下降(P0.05)。1.2在用藥開始2周、4周、6周各實(shí)驗(yàn)組均有大鼠不同程度的死亡,與缺血模型組比較,宣痹通瘀方高劑量組大鼠死亡率明顯下降(P0.05)。模型組動(dòng)物心肌三酶AST、CK和LDH釋放入血量均明顯高于假手術(shù)組(均為P0.001)。給予宣痹通瘀方干預(yù)4w后,與模型對(duì)照組比較,宣痹通瘀方高劑量可以顯著降低AST、CK、LDH含量及MDA活性,升高SOD活性(P0.01或P0.05);宣痹通瘀方中劑量可以顯著降低AST、LDH含量及MDA活性,升高SOD活性(P0.05和P0.01);宣痹通瘀方低劑量可以明顯降低LDH活性(P0.05)。與缺血模型對(duì)照組比較,宣痹通瘀方高中劑量給藥組動(dòng)物均可以明顯降低動(dòng)物組織中的cTn的含量(P0.001;P0.01或P0.05),并依據(jù)給藥劑量不同呈現(xiàn)較好的量-效關(guān)系。與缺血模型對(duì)照組比較,宣痹通瘀方高中劑量組動(dòng)物心肌梗死面積明顯減小(P0.01和P0.05)。光鏡觀察左心室縱切片HE染色,假手術(shù)組心肌細(xì)胞排列整齊,結(jié)構(gòu)清晰;心肌缺血模型組大鼠心肌細(xì)胞可見凝固性壞死,核碎裂消失;宣痹通瘀方高劑量組及麝香保心丸組心肌細(xì)胞病理損傷有改善,心肌細(xì)胞排列較規(guī)則;1.3免疫組化結(jié)果:與模型組比較,麝香保心丸組、宣痹通瘀高劑量組、中劑量組、低劑量組動(dòng)物心肌組織內(nèi)VEGF含量有顯著性增高(P0.01,P0.001,P0.01,P0.05);與模型組比較,麝香保心丸組、宣痹通瘀中劑量、高劑量心肌組織內(nèi)Notch1含量明顯降低(P0.01,P0.05);1.4免疫熒光結(jié)果:與模型組比較,麝香保心丸陽性對(duì)照組、宣痹通瘀低、中、高劑量組處理后的大鼠心肌組織CD34含量極顯著升高(P㩳0.01)。1.5 RT-PCR結(jié)果:與假手術(shù)組比較,心肌缺血模型組的VEGF、Notch1、Dell4mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(p0.01);與模型組比較,麝香保心丸陽性對(duì)照組、宣痹通瘀方低、中、高劑量組心肌組織中VEGFmRNA的表達(dá)上調(diào)(P0.01,P0.001);麝香保心丸陽性對(duì)照組、宣痹通瘀低、中劑量組Notch1mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05,p0.01);麝香保心丸陽性對(duì)照組、宣痹通瘀方低、中、高劑量組Dell4mRNA的表達(dá)下調(diào)(p0.01,p0.05);1.6 Western blotting結(jié)果:與假手術(shù)組比較,模型大鼠VEGF、Notch1、Dell4蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(p0.05,p0.01);與模型組比較,宣痹通瘀方低、中、高劑量組及麝香保心丸陽性對(duì)照組VEGF蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(p0.05,p0.01);宣痹通瘀方中、高劑量組Notch1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(p0.05,p0.01);宣痹通瘀方中、高劑量組大鼠心肌組織中Dell4蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(p0.01,p0.001);2.宣痹通瘀方對(duì)缺血缺氧刺激的HUVEC血管內(nèi)皮細(xì)胞Notch-Dell4通路的影響2.1 CCK8測(cè)定各個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)缺血缺氧對(duì)細(xì)胞存活率的影響與模型組比較,2h中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、陽性藥物處理組,細(xì)胞存活率變化不明顯,4h中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、陽性藥物處理組細(xì)胞存活率均上升且成劑量依賴增加,與模型組比較有顯著差異(P0.01和P0.001)。2.2 RT-PCR結(jié)果:與對(duì)照組比較,細(xì)胞缺血缺氧模型組VEGFmRNA的表達(dá)顯著下降(P0.001),Notch1、Dell4mRNA表達(dá)顯著上升(P0.01);與缺血缺氧模型組比較,麝香保心丸陽性對(duì)照組、宣痹通瘀方低、中、高劑量組細(xì)胞中VEGF mRNA表達(dá)顯著上升(P0.01,P0.001);麝香保心丸陽性對(duì)照組、宣痹通瘀方高劑量組細(xì)胞中Notch1mRNA的表達(dá)顯著下降(P0.01);麝香保心丸陽性對(duì)照組、宣痹通瘀方中、高劑量組細(xì)胞中Dell4mRNA表達(dá)顯著下降(P0.05,P0.01);2.3 Western blot結(jié)果:與對(duì)照組比較,缺血缺氧組VEGF蛋白的表達(dá)顯著下降(P0.001),Notch1、Dell4蛋白的表達(dá)顯著上升(P0.01);與缺血缺氧模型組比較,麝香保心丸陽性對(duì)照組、宣痹通瘀方高劑量組VEGF蛋白表達(dá)顯著上升(P0.01,P0.001);麝香保心丸陽性對(duì)照組、宣痹通瘀方中、高劑量組中Notch1蛋白的表達(dá)顯著下降(P0.01,P0.05),麝香保心丸陽性對(duì)照組、宣痹通瘀方中、高劑量組細(xì)胞中Dell4蛋白的表達(dá)顯著下降(P0.05,P0.001);2.4細(xì)胞成管檢測(cè):與空白對(duì)照組相比,缺氧條件下HUVEC細(xì)胞管腔形成能力下降,主要表現(xiàn)為斷裂管腔增多,管腔的完整性受到嚴(yán)重破壞;與缺血缺氧組比較隨著宣痹通瘀含藥血清劑量的增加,管腔受損逐漸減弱,但管腔形成能力較空白對(duì)照組弱。2.5細(xì)胞遷移檢測(cè):與空白對(duì)照組比較,缺血缺氧處理組、中藥高劑量組、陽性藥物處理組穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少(P0.001、P0.01和P0.05);與缺血缺氧組比較,隨著宣痹通瘀含藥血清劑量的增加,細(xì)胞遷移能力逐漸增強(qiáng),但遷移能力較正常組弱。結(jié)論:1宣痹通瘀方能夠降低實(shí)驗(yàn)性心肌缺血病變大鼠死亡率,并具有改善心肌缺血大鼠異常心電圖的作用;2宣痹通瘀方能夠降低實(shí)驗(yàn)性心肌缺血病變大鼠心肌三酶和肌鈣蛋白,可以改善心肌抗氧化作用,能夠減少心肌梗死面積,能夠促進(jìn)心肌梗死區(qū)血管新生,具有保護(hù)心肌組織結(jié)構(gòu)和功能的作用;3宣痹通瘀方能明顯升高心肌缺血大鼠心肌組織VEGF的表達(dá),抑制心肌缺血大鼠心肌組織Notch1、Dell4的表達(dá);4宣痹通瘀方能明顯上調(diào)缺血缺氧HUVEC血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF基因和蛋白的表達(dá),下調(diào)缺血缺氧HUVEC血管內(nèi)皮細(xì)胞Notch1、Dell4基因和蛋白的表達(dá);5宣痹通瘀方能夠促進(jìn)缺血缺氧HUVEC的遷移及成管;6宣痹通瘀方可以促進(jìn)冠心病心肌缺血組織的血管新生,其作用機(jī)制可能與促進(jìn)VEGF表達(dá)升高,調(diào)控了Notch-Dell4信號(hào)通路相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

醫(yī)藥大學(xué) 2018 屆博士學(xué)位論文 實(shí)驗(yàn)研組細(xì)胞管腔形成實(shí)驗(yàn)與空白對(duì)照組相比，缺氧條件下 HUVEC 細(xì)胞管腔形成能力下降，主要表現(xiàn)增多，管腔的完整性受到嚴(yán)重破壞，與缺血缺氧組比較隨著中藥含藥血清劑管腔受損逐漸減弱，但管腔形成能力較空白對(duì)照組弱。

長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 2018 屆博士學(xué)位論文 實(shí)驗(yàn)研究3.6 各組細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Transwell 遷移實(shí)驗(yàn)顯示，缺血缺氧處理組穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組減少，差異極顯著（P<0.001）；中藥高劑量組穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組減少，差異極顯著（P<0.01）；陽性藥物處理組穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)較空白對(duì)照組減少，差異顯著（P<0.05）。與空白對(duì)照組相比，缺氧導(dǎo)致 HUVEC 遷移能力減弱，與缺血缺氧組比較，隨著中藥含藥血清劑量的增加，遷移能力逐漸增強(qiáng)，但遷移能力較正常組弱。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2776096