【摘要】：蟾酥為蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍等蟾蜍的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液經加工干燥制成的名貴中藥材。蟾酥具有很高的藥用價值,然而因毒副作用較大而限制了其應用。微生物轉化作為運用于食品、藥品等工業(yè)化的經典技術,其具有提高藥性、減小毒性、增加適應癥等特點。本文就蟾酥的微生物轉化進行研究,揭示蟾酥微生物轉化的特點及蟾酥抗腫瘤的作用機理。通過細胞水平及動物水平的研究,利用MTT法發(fā)現濃度為0.001-1.0 mg/ml蟾酥均能夠有效抑制肺癌細胞A549的增殖,通過流式細胞術定性檢測發(fā)現濃度為0.00001、0.005、0.01 mg/ml蟾酥能夠誘導肺癌細胞A549的早期凋亡,而濃度為0.05、0.1 mg/ml蟾酥能夠誘導肺癌細胞A549的晚期凋亡及壞死,且促凋亡蛋白Bax及Bad蛋白的表達均明顯上調。透電鏡下觀察經蟾酥干預后的肺癌細胞A549明顯呈不規(guī)則形態(tài)。利用移植瘤裸鼠造模及干預,發(fā)現第7周時蟾酥能有效抑制瘤體的生長。通過采集不同環(huán)境的土壤樣本,加入10倍量的無菌水混勻,得到的土壤懸液用無菌水稀釋100倍后在含濃度為0.5 mg/ml的蟾酥轉化培養(yǎng)基上能較好地篩選出抗蟾酥毒性的菌株。根據菌落的形態(tài)、顏色、質地篩選得到150余株微生物菌種,編號為1-150。根據微生物對蟾酥的轉化能力從中篩選出1株能充分轉化蟾酥中成分為酯蟾毒配基的微生物菌株,編號為BV-77。對菌株BV-77 DNA進行提取并對16S r DNA進行擴增,測序。通過對BLAST比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹的分析,確定了其種屬分類地位。菌株BV-77鑒定結果為:Bacillus marisflavi TF-11門(Firmicutes)、芽孢桿菌綱(Bacilli)、芽孢桿菌目(Bacillales)、芽孢桿菌屬(Bacillus)。運用薄層層析法確定各個成分Rf值,其中酯蟾毒配基Rf值為0.81,華蟾酥毒基Rf值為0.71,蟾毒靈Rf值為0.62,蟾毒它靈Rf值為0.50,遠華蟾毒精Rf值為0.42,沙蟾毒精Rf值為0.31。TLC法鑒別蟾酥及其轉化產物的所含成分,發(fā)現菌株BV-77可以有效轉化蟾酥中含量較高的酯蟾毒配基,生成產物遠華蟾毒精。通過高效液相色譜法進行定性定量檢測,HPLC條件為流動相為0.1%甲酸水(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0-15 min:70%A→45%A;15-40 min:55%A),流速0.7 ml/min,柱溫40℃,進樣量10μl,檢測波長296 nm,通過外標法計算出底物中酯蟾毒配基和遠華蟾毒精的占比分別為11.63%、0.63%,轉化產物中酯蟾毒配基和遠華蟾毒精的占比分別為0.13%、11.29%,且該體系轉化效率達到82.20%。比較蟾酥及轉化產物兩者對肺癌細胞A549的抗腫瘤效果。通過MTT法發(fā)現0.001-1.0 mg/ml轉化產物的增殖抑制效果均優(yōu)于底物蟾酥,且0.001-0.1 mg/ml轉化產物較同濃度的底物蟾酥對正常細胞的毒性有所減小。利用流式細胞術發(fā)現0.1 mg/ml及0.5 mg/ml轉化產物較蟾酥更能夠促使細胞內產生大量ROS。利用蛋白免疫印記技術發(fā)現轉化產物能夠誘導促凋亡蛋白Bad及Bax高表達,且效果優(yōu)于底物蟾酥。結合分子生物學方法,探索蟾酥及轉化產物抑制腫瘤的分子機制。發(fā)現了兩者激活能量代謝調控中心AMPK并在糖酵解水平及線粒體功能兩大方面具有顯著的影響。其通過抑制糖酵解通路關鍵限速蛋白HK2、PKM2的表達、降低P-PFK-2/PFK-2酵解速率及損傷線粒體結構、改變線粒體功能,上調線粒體分蛋白Drp1及自噬蛋白Beclin的的表達來達到對肺癌細胞A549的殺傷作用。
【學位授予單位】：上海師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

蟾蜍內酯類化合物根母核結構

圖 2-1 不同濃度蟾酥對肺癌細胞 A549 增殖抑制率1 Inhibition rate of lung cancer cell A549 by Venenum bufonis at different concentrati*,p<0.05; **, p<0.01，***, p<0.001，n=5

圖 2-2 不同濃度蟾酥對 Annexin V 染色的熒光偏移強度ig.2-2 Fluorescence migration intensity ofAnnexin V staining with Venenum bufonisdifferent concentrations

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