【摘要】：目的:1.研究草蓯蓉環(huán)烯醚萜苷(IGBR)含藥血清對人肝癌SMMC-7721、HepG2和SK-Hep1細胞生長的抑制作用。2.研究IGBR含藥血清誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細胞凋亡的作用,探討其作用機制。3.觀察二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)肝癌大鼠的肝功能和肝組織病理變化,研究IGBR的抗氧化和誘導(dǎo)細胞凋亡的作用,探討其作用機制。方法:1.體外實驗:(1)含藥血清的制備:雄性Wistar大鼠每組6只,隨機分為對照組、5-氟尿嘧啶(5-FU)組、IGBR低、中、高劑量組。每日1次給予對照組大鼠2mL生理鹽水,5-FU組大鼠75mg/kg 5-FU,IGBR組大鼠分別給予 125mg/kg、250mg/kg、500mg/kgIGBR連續(xù)灌胃1個月后處死各組大鼠,采集心臟血液,3 000轉(zhuǎn)離心20min,56℃恒溫水浴30 min,滅活血清中的補體及其他活性成分,-20℃保存?zhèn)溆谩?2)體外培養(yǎng)人肝癌SMMC-7721、HepG2和SK-Hep1細胞株,以常規(guī)化療藥物5-FU為陽性對照,通過四甲基偶氮唑藍法(MTT法)檢測肝癌細胞增殖能力,流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率,熒光顯微鏡觀察肝癌細胞形態(tài)變化,蛋白印跡法(Western Blot)檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達。2.體內(nèi)實驗:(1)DEN誘發(fā)大鼠原發(fā)性肝癌模型的制備:雄性Wistar大鼠每組33只,隨機分為對照組、肝癌組、5-FU組及IGBR組。造模第一天對照組大鼠給予腹腔注射1次0.1 mL/100 g生理鹽水,余3組大鼠給予腹腔注射1次200 mg/kg DEN;然后給予各組大鼠0.05%的DEN水溶液自由飲用。第二天開始5-FU組大鼠每周腹腔注射3次25 mg/kg 5-FU;IGBR組大鼠每日灌胃1次500 mg/kg IGBR。實驗第12、20周末各組大鼠均處死6只,第28周末各組大鼠均處死20只,采集心臟血液,福爾馬林固定肝臟。(2)以全自動生化分析儀檢測大鼠肝功能;谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)的含量參照試劑盒操作步驟進行測定;用比色法測定肝組織抗氧化酶活性;通過HE染色觀察肝組織病理變化、利用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)檢測肝細胞凋亡率、Western Blot法檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果:1.體外實驗:(1)5-FU含藥血清和IGBR含藥血清能夠抑制人肝癌SMMC-7721、HepG2和SK-Hep1細胞的增殖,有濃度和時間依賴性。(2)5-FU含藥血清和IGBR含藥血清作用于人肝癌SMMC-7721細胞后,出現(xiàn)細胞皺縮、變圓、細胞核固縮等典型的細胞凋亡改變;與對照組相比,5-FU組和IGBR組細胞凋亡率上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),IGBR高劑量組和5-FU組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(3)5-FU含藥血清和IGBR含藥血清作用于人肝癌SMMC-7721細胞后,與對照組相比5-FU組和IGBR中、高劑量組半胱天冬氨酸蛋白-3(Caspase-3)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK)、磷酸化p38MAPK激酶(p-p38)蛋白表達增多,而B細胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-ERK)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表達減少,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),IGBR高劑量組和5-FU組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);但ERK、JNK、p38、Akt蛋白表達無顯明變化。采用絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)抑制劑分別作用后進一步證實IGBR含藥血清通過調(diào)節(jié)上述信號傳導(dǎo)通路,抑制肝癌細胞的生長,誘導(dǎo)細胞凋亡。2.體內(nèi)實驗:(1)給予大鼠灌胃DEN28周后,成功誘發(fā)原發(fā)性肝癌大鼠模型。與對照組相比,肝癌組大鼠毛發(fā)無光澤、粗糙、精神萎靡不振,肝重下降呈暗紅色、質(zhì)地堅硬、肝結(jié)節(jié)融合形成包塊;與肝癌組相比,IGBR組和5-FU組大鼠上述變化較輕,但肝重?zé)o明顯變化。(2)與對照組相比,肝癌組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)活性、GST、γ-GT含量和肝組織抗氧化酶水平增高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與肝癌組相比,5-FU組與IGBR組大鼠血清ALT和AST活性、GST、γ-GT含量和肝組織抗氧化酶水平降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),IGBR組和5-FU組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(3)HE染色結(jié)果:肝癌組大鼠肝組織病理改變主要表現(xiàn)為肝臟炎癥反應(yīng)、肝硬化和肝癌三個階段。與對照組相比,肝癌組出現(xiàn)細胞核大、深染,肝異型增生的癌變細胞。與肝癌組相比,5-FU組與IGBR組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本存在,可見點狀、灶狀壞死,細胞核異型性較大,誘癌的三個階段的病理變化明顯改善。(4)TUNEL檢測結(jié)果:與對照組相比,肝癌組大鼠肝臟肝細胞凋亡增加,細胞質(zhì)呈棕黃色,凋亡的肝細胞皺縮、核固縮及核仁消失。與肝癌組相比,5-FU組與IGBR組細胞凋亡增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),IGBR組和5-FU組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(5)免疫組化結(jié)果:磷蛋白53(p53)、Bcl-2、磷蛋白21(p21)和c-myc陽性細胞主要分布于不典型增生灶和癌灶中,表達于胞漿。與對照組相比,肝癌組p53、Bcl-2、p21和c-myc表達增多,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與肝癌組相比,5-FU組和IGBR組p53、p21表達增多,而Bcl-2和c-myc表達減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),IGBR組和5-FU組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(6)Western Blot檢測結(jié)果:與對照組相比,肝癌組p-ERK、p-Akt表達減少,p-JNK、p-p38表達增多,均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);ERK、p38、JNK、Akt表達無顯明變化。與肝癌組相比,5-FU組與IGBR組p-ERK、p-Akt蛋白表達減少,p-JNK、p-p38蛋白表達增多,均有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05);IGBR組和5-FU組間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:1.IGBR含藥血清能夠抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖。2.IGBR含藥血清誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細胞凋亡,且呈濃度依賴性。3.MAPK和PI3K/Akt信號傳導(dǎo)通路參與調(diào)節(jié)IGBR含藥血清誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細胞凋亡。4.IGBR可通過提高肝組織抗氧化活性,保護DEN誘發(fā)肝癌大鼠肝臟。5.IGBR通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白及肝癌相關(guān)信號傳導(dǎo)通路蛋白的表達,誘導(dǎo)細胞凋亡,抑制DEN誘發(fā)大鼠肝癌細胞的生長。
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

邐延邊大學(xué)博士學(xué)位論文第三章結(jié)果逡逑３．１ＩＧＢＲ含藥血清對人肝癌細胞增殖的影響逡逑３．１．１邋ＩＧＢＲ含藥血清對人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１細胞增殖活力的影響逡逑５－ＦＵ含藥血清和不同濃度ＩＧＢＲ含藥血清作用于人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１細２４邋ｈ后，細胞活力分另ＩＪ降低為７３．２邋％、８６．１％、８０．２邋％和７５．３％，與對照組相有統(tǒng)計學(xué)差異ＣＰ＜0．0５），邋５－ＦＵ組殺傷作用略強于ＩＧＢＲ組；繼續(xù)作用至４８邋ｈ后細胞活力進一步降低為５６．２邋％、６８．３邋％、６１．１邋％和５８．２邋％，與對照組相比有統(tǒng)學(xué)差異（尸＜0．0５），５－ＦＵ組殺傷作用略強于ＩＧＢＲ組，見圖３－１。實驗結(jié)果說明ＩＧＢ含藥血清可降低人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１細胞活力，并呈濃度和時間依賴性。逡逑２４邋ｈ逡逑

邐延邊大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑本實驗還選用了兩種人肝癌ＨｅｐＧ２和ＳＫ－Ｈｅｐｌ細胞，觀察５－ＦＵ含藥血清逡逑和ＩＧＢＲ含藥血清對人肝癌細胞增殖的作用，進一步驗證ＩＧＢＲ含藥血清對肝癌逡逑細胞的抑制作用。檢測結(jié)果顯示：５－ＦＵ含藥血清和ＩＧＢＲ含藥血清可抑制人肝逡逑癌ＨｅｐＧ２和ＳＫ－Ｈｅｐｌ細胞增殖，并呈濃度和時間依賴性。如圖３－２所示：５－ＦＵ逡逑含藥血清和不同濃度ＩＧＢＲ含藥血清作用人肝癌ＨｅｐＧ２和ＳＫ－Ｈｅｐ邋１細胞２４邋ｈ后，逡逑細胞活力分另丨Ｊ降低為邋７６．１％、８７．２邋％、８３．１邋％、７８．３邋％和邋７７．２邋％、８８．１邋％、８３＿３邋％、逡逑７９．２％，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（Ｐ＜０．０５），５－ＦＵ組殺傷作用略強于ＩＧＢＲ組；逡逑作用４８邋ｈ后，細胞活力進一步降低為６４．１邋％、７７．１邋％、７２．３邋％、６６．２邋％和６８．１邋％、逡逑８１．２％、７６．２％、７０．１％，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（Ｐ＜０．０５），邋５－ＦＬＪ組殺傷作逡逑用略強于ＩＧＢＲ組。逡逑２４邋ｈ逡逑

３．２邋ＩＧＢＲ含藥血清對人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１細胞形態(tài)的影響逡逑５－ＦＵ含藥血清和不同濃度ＩＧＢＲ含藥血清干預(yù)４８邋ｈ后，倒置顯微鏡下觀察逡逑人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１細胞形態(tài)，結(jié)果如圖３－３所示：對照組細胞完全貼壁、緊密逡逑相連、均勻透亮呈梭狀；而５－ＦＵ含藥血清和ＩＧＢＲ含藥血清處理后細胞發(fā)生壞逡逑死、變性，體積縮小、數(shù)目減少，且細胞壞死程度隨著ＩＧＢＲ給藥劑量的增加逐逡逑漸加重，且貼壁不牢固，出現(xiàn)脫落現(xiàn)象。５－ＦＵ組細胞壞死程度比較嚴(yán)重，細胞逡逑數(shù)目較少，細胞稀疏較為明顯。與５－ＦＵ組相比，ＩＧＢＲ組細胞壞死程度較低。逡逑１１逡逑

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 呂高波;趙陽;;HBx和c-Src對肝癌細胞HepG2上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的介導(dǎo)作用及其分子機制[J];山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2015年12期

2 Mitsuro Kanda;Hiroyuki Sugimoto;Yasuhiro Kodera;;Genetic and epigenetic aspects of initiation and progression of hepatocellular carcinoma[J];World Journal of Gastroenterology;2015年37期

3 尹學(xué)哲;王玉嬌;尹基峰;金梅花;金明;全吉淑;;草蓯蓉提取物對HepG2細胞氧化應(yīng)激損傷的保護作用[J];食品科學(xué);2015年15期

4 王喜軍;;中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的系統(tǒng)方法學(xué)——中醫(yī)方證代謝組學(xué)[J];中國中藥雜志;2015年01期

5 劉利敏;李繼坤;;E-cadherin、Snail、Twist在胃癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶中的表達及臨床意義[J];實用臨床醫(yī)藥雜志;2014年21期

6 陳闖;;中醫(yī)藥防治原發(fā)性肝癌機制的研究進展[J];實用中西醫(yī)結(jié)合臨床;2014年10期

7 李志銘;朱穎杰;;JAK/STAT通路及其阻斷劑AG490在淋巴瘤中的研究進展[J];中國腫瘤臨床;2014年19期

8 Fen Lin;Wei Yan;Gang Song;Wen Ting;Tianhui Hu;Guoyang Wu;;Metformin targets liver tumor-initiating cells through the PI3K/Akt/mTOR survival pathway[J];Chinese Science Bulletin;2014年28期

9 李仲誠;阮禮波;楊帆;李靜雅;李佳;湯杰;;死亡相關(guān)凋亡誘導(dǎo)蛋白激酶2(DRAK2)研究進展[J];生命科學(xué);2014年08期

10 常中飛;王茂強;劉鳳永;段峰;王志軍;宋鵬;;γ-谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶對中期原發(fā)性肝癌患者預(yù)后的意義[J];中華介入放射學(xué)電子雜志;2014年03期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 于里涵;microRNA-192-5p調(diào)控LIV-1-ZEB2通路對肝細胞癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的抑制作用及機制研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

本文編號：2776036