發(fā)布時(shí)間：2020-07-30 10:03

【摘要】：背景:關(guān)節(jié)炎是一種發(fā)生在人關(guān)節(jié)及周圍組織的炎癥,引起關(guān)節(jié)炎的因素有很多,可能是炎癥、感染、創(chuàng)傷等等。關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)為關(guān)節(jié)紅腫,熱,痛。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國50歲以上人群中關(guān)節(jié)炎的患病率在50%以上,關(guān)節(jié)炎對患者正常生活有著極大的影響,嚴(yán)重者生活不能自理,導(dǎo)致關(guān)節(jié)殘疾等。西瑞香素(Daphnoretin),化學(xué)名7-羥基-6-甲氧基-3,7'-雙香豆素酯,又名了哥王素,在眾多豆科、蕓香科和瑞香科的植物中有較豐富的含量,經(jīng)提取純化工藝后可得西瑞香素。在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中使用含有西瑞香素的了哥王、祖師麻等藥材治療關(guān)節(jié)炎等炎癥。另據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,西瑞香素還具有抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗焦慮、抗病毒等功效,故本課題將西瑞香素作為主要研究對象,以提高西瑞香素實(shí)用性。目的:通過THP-1細(xì)胞炎癥模型的藥效實(shí)驗(yàn)、ELISA實(shí)驗(yàn)檢測各細(xì)胞因子受西瑞香素的影響,來驗(yàn)證西瑞香素的抗炎效果。建立Caco-2細(xì)胞的Tanswell模擬小腸轉(zhuǎn)運(yùn)模型,通過比較西瑞香素在能量抑制劑、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑的存在下西瑞香素在Tanswell模擬小腸轉(zhuǎn)運(yùn)模型中的吸收情況,研究西瑞香素在人體腸道中的吸收機(jī)制,來為以后西瑞香素藥代動(dòng)力學(xué)和臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。方法:第一部分抗炎實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)采用了CCK-8法檢測不同濃度的西瑞香素對THP-1細(xì)胞活性的影響,并通過ELISA實(shí)驗(yàn)檢測經(jīng)LPS(脂多糖)誘導(dǎo)后THP-1細(xì)胞炎癥模型分泌的各細(xì)胞因子的水平,和經(jīng)西瑞香素處理后對細(xì)胞因子分泌量的影響,來驗(yàn)證西瑞香素對炎癥細(xì)胞的作用。第二部分轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制研究中,使用經(jīng)典的MTT法檢測西瑞香素對Caco-2細(xì)胞的毒性,來決定實(shí)驗(yàn)中西瑞香素的濃度區(qū)間。采用Caco-2(結(jié)腸腺癌細(xì)胞)建立Transwell轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞模型,使用細(xì)胞電阻儀檢測單細(xì)胞膜的生長程度,并通過檢測細(xì)胞分泌的AKP(堿性磷酸酶)的濃度來觀察Caco-2單細(xì)胞膜分化的程度,通過酚紅實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證細(xì)胞單層膜的完整性。利用建立的Caco-2細(xì)胞的Tanswell模擬小腸轉(zhuǎn)運(yùn)模型,結(jié)合能量抑制劑和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑,通過HPLC(高效液相)法檢測Transwell轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞模型的上下室中的西瑞香素的含量,來研究西瑞香素通過人體小腸上皮細(xì)胞吸收的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。結(jié)果:CCK-8法檢測不同濃度的西瑞香素對THP-1細(xì)胞活性的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在西瑞香素濃度高于10μg/ml時(shí)可以明顯的抑制TNF-α炎癥因子的分泌(P0.05),在濃度高于1μg/ml時(shí)可以明顯的抑制MCP-1,IL-1β炎癥因子的分泌(P0.05),50μg/ml、20μg/ml、10μg/ml三種濃度的西瑞香素對IL-6炎癥因子的分泌有影響,分泌水平明顯受到西瑞香素濃度的影響P值均小于0.05,但作用時(shí)間為12h西瑞香素濃度是10μg/ml的一組對比LPS組并沒有顯著性。采用MTT法測定西瑞香素對Caco-2的細(xì)胞毒性,結(jié)果表明西瑞香素溶液濃度在20μg/ml以下時(shí)對Caco-2細(xì)胞毒性可以忽略不計(jì)。在建立Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)模型并驗(yàn)證模型可靠性后,實(shí)驗(yàn)通過加入不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑來研究西瑞香素的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明加入能量抑制劑后西瑞香素在模型中的轉(zhuǎn)運(yùn)AP-BL和BL-AP均受到顯著影響(P0.05)表明西瑞香素的轉(zhuǎn)運(yùn)是一種能量依賴性的過程。加入P-gp蛋白抑制劑后西瑞香素轉(zhuǎn)運(yùn)沒有受到顯著性的影響(P0.05),表明P-gp蛋白并未參與西瑞香素的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。加入MRP2蛋白抑制劑后,西瑞香素AP-BL的Papp提高了7.1%,BL-AP方向并沒有受到顯著性影響,此處提示西瑞香素的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中可能有MRP2蛋白的參與。加入BCRP蛋白抑制劑后AP-BL方向轉(zhuǎn)運(yùn)與西瑞香素組并沒有顯著性差異(P0.05),但BL-AP方向轉(zhuǎn)運(yùn)的表觀滲透系數(shù)較西瑞香素組降低了23.8%,且PAB/PBA為0.75說明西瑞香素轉(zhuǎn)運(yùn)過程中有BCRP蛋白的參加。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)西瑞香素對細(xì)胞分泌炎癥因子具有較強(qiáng)的抑制作用,但對THP-1細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)沒有較大影響,本實(shí)驗(yàn)建立Caco-2細(xì)胞Transwell模型可用于研究西瑞香素在人體細(xì)胞中的吸收分布代謝,為西瑞香素的下一步研究打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285
【圖文】：

；西瑞香素以線粒體介導(dǎo)的方式促進(jìn) Hela 細(xì)胞能成為治療子宮頸癌的藥物；張玉靜研究了西作用和西瑞香素對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用以及對過建立西瑞香素的 HPLC 檢測方法測定了不同[38]；研究發(fā)現(xiàn)西瑞香素對破骨細(xì)胞的分化有抑促進(jìn)作用[39]。根據(jù)以上研究成果可以發(fā)現(xiàn)，西掘出來，表明其藥用價(jià)值仍有待進(jìn)一步的研究。及意義究了西瑞香素在 LPS（脂多糖）誘導(dǎo)的 THP-1效學(xué)，通過考察炎癥細(xì)胞分泌的各項(xiàng)細(xì)胞因子果。之后在此基礎(chǔ)上通過 Transwell 細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)吸收情況下的吸收機(jī)制，通過研究藥物的吸收制和解決藥物的實(shí)際運(yùn)用中出現(xiàn)的各項(xiàng)問題提物的代謝動(dòng)力學(xué)做鋪墊。

著差異（P>0.05）。如圖 3 所示西瑞香素+LPS 組對比空白組明顯下降（P<0.05），西瑞香素+LPS 組對比 LPS 細(xì)胞活力無明顯差異（P<0.05）。圖 2 不同濃度西瑞香素對 THP-1 細(xì)胞活力的影響

第一章 THP-1 細(xì)胞炎癥模型中西瑞香素的抗炎效果（P<0.05）。西瑞香素各濃度組對比空白組細(xì)胞活力相差不大，經(jīng)數(shù)據(jù)分析無顯著差異（P>0.05）。如圖 3 所示西瑞香素+LPS 組對比空白組明顯下降（P<0.05）西瑞香素+LPS 組對比 LPS 細(xì)胞活力無明顯差異（P<0.05）。

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本文編號：2775385