發(fā)布時(shí)間：2020-07-30 07:49

【摘要】：目的:肝豆湯為中醫(yī)治療肝豆?fàn)詈俗冃?Hepatolenticular Degeneration,HLD)的經(jīng)典方,由于臨床療效確切,該方被《肝豆?fàn)詈俗冃栽\斷與治療指南》推薦為治療HLD基本方劑,臨床上一直沿用至今。目前由于缺乏對(duì)肝豆湯的化學(xué)成分和體內(nèi)過(guò)程研究,該方物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確,限制了該方的應(yīng)用和發(fā)展。本論文利用超高效液相色譜(UPLC)及超高效液相色譜時(shí)間飛行質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-Q-TOF-MS)技術(shù)對(duì)肝豆湯中化學(xué)成分及大鼠體內(nèi)代謝物進(jìn)行系統(tǒng)分析研究,為揭示肝豆湯的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:通過(guò)色譜條件摸索,建立了肝豆湯UPLC指紋圖譜質(zhì)量控制方法;采用UPLC-Q-TOF-MS~E技術(shù)結(jié)合UNIFI分析平臺(tái)建立肝豆湯化學(xué)成分的快速分析方法,構(gòu)建肝豆湯質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)該方整體化學(xué)成分進(jìn)行了分類和歸屬;通過(guò)構(gòu)建銅負(fù)荷大鼠模型,灌胃給藥肝豆湯,采用UPLC-Q-TOF-MS~E技術(shù),結(jié)合體外化學(xué)成分信息,鑒定大鼠口服肝豆湯后入血、入肝成分,探討肝豆湯在銅負(fù)荷模型大鼠和正常大鼠體內(nèi)吸收代謝差異;在此基礎(chǔ)上采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)結(jié)合非靶標(biāo)代謝組學(xué)的方法,進(jìn)一步對(duì)肝豆湯在大鼠尿液中的原型成分和代謝物進(jìn)行分析,對(duì)肝豆湯在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物及代謝途徑進(jìn)行了系統(tǒng)研究。結(jié)果:1.建立了不同批次肝豆湯的UPLC指紋圖譜方法,確定了17個(gè)共有峰,通過(guò)精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證;采用UPLC-Q-TOF-MS~E技術(shù)結(jié)合UNIFI天然產(chǎn)物分析策略,建立了復(fù)方肝豆湯數(shù)據(jù)庫(kù),對(duì)肝豆湯中的化學(xué)成分進(jìn)行了分析鑒定,共計(jì)鑒別出96個(gè)化合物,對(duì)每個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行總結(jié)歸類并對(duì)其單味藥來(lái)源進(jìn)行歸屬,包括21個(gè)蒽醌類化合物,14個(gè)生物堿類化合物,17個(gè)原萜烷型三萜類化合物,10個(gè)黃酮化合物,8個(gè)皂苷類化合物,10個(gè)鞣質(zhì)類成分,4個(gè)姜黃素類化合物,2個(gè)苯丁酮苷,4個(gè)倍半萜類和6個(gè)其他類成分,全面系統(tǒng)地分析了肝豆湯中的化學(xué)成分。結(jié)果表明,本方法能夠快速全面地對(duì)肝豆湯化學(xué)成分進(jìn)行鑒別。2.構(gòu)建銅負(fù)荷大鼠模型,采用UPLC-Q-TOF-MS~E技術(shù)結(jié)合UNIFI分析平臺(tái)鑒定了大鼠口服肝豆湯入血入肝原型成分及代謝物。正常給藥大鼠血漿中共檢測(cè)到54個(gè)成分入血,包含36個(gè)原型入血成分,18個(gè)代謝產(chǎn)物,其中有21種原型成分及8個(gè)代謝產(chǎn)物在正常大鼠肝組織中被檢測(cè)到。在銅負(fù)荷模型大鼠血漿中共檢測(cè)到46個(gè)成分入血,包含30個(gè)原型入血成分和16個(gè)代謝產(chǎn)物,其中有18種原型成分及5個(gè)代謝產(chǎn)物在正常大鼠肝組織中被檢測(cè)到。入血的主要成分為蒽醌,生物堿和原萜烷型四環(huán)三萜類成分,還有少量皂苷、黃酮和鞣質(zhì)類成分;大黃中的蒽醌及澤瀉的原萜烷型四環(huán)三萜類成分是主要的入肝成分。3.采用UPLC-Q-TOF-MS結(jié)合非靶標(biāo)代謝組學(xué)方法分析大鼠口服肝豆湯后尿液中的成分,在大鼠體內(nèi)共檢測(cè)到77種化學(xué)成分,包括45種原型成分和32種代謝產(chǎn)物,主要為蒽醌類、原萜烷型萜類化合物及少量皂苷黃酮鞣質(zhì)類化合物,對(duì)肝豆湯體內(nèi)成分進(jìn)行了系統(tǒng)闡明,并推斷肝豆湯中蒽醌類成分在大鼠體內(nèi)的主要代謝途經(jīng)為葡萄糖醛酸化和硫酸化;生物堿類成分的主要代謝途經(jīng)為羥基化、去甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化等,為肝豆湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。該方法可作為中藥復(fù)方代謝物組快速鑒定的重要工具。結(jié)論:本研究建立了肝豆湯中化學(xué)成分和體內(nèi)代謝物的快速篩選和鑒定方法,初步闡明了該方化學(xué)成分和體內(nèi)代謝情況,為該方質(zhì)量控制及物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

圖 1 不同波長(zhǎng)下肝豆湯色譜圖Fig 1 The chromatograms of GDD in different wavelengths:203nm; B:210nm; C:230nm; D:260nm; E:280nm; F:320nm的選擇同組成的流動(dòng)相（甲醇-水，乙腈-水）對(duì)肝豆湯各成流動(dòng)相，經(jīng)過(guò)多次預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索，確定實(shí)驗(yàn)的色譜條ilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；-乙腈 B；流速：0.3 mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：

3.1.3 重復(fù)性取同一批次肝豆湯按照“2.1”項(xiàng)下方法平行制備肝豆湯供試液 6 份，并按“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件，記錄 UPLC 圖譜，得到峰面積，結(jié)果各峰的相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的 RSD 值均小于 3.0%，表明該方法的重復(fù)性良好。3.2 肝豆湯的 UPLC 指紋圖譜相似度分析10 批復(fù)方肝豆湯 UPLC 指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜特征圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2004 A 版），利用中位數(shù)法，時(shí)間窗為 0.1 min，生成十個(gè)批次復(fù)方肝豆湯共有模式下的指紋圖譜及對(duì)照譜圖，見(jiàn)圖 2，找出 17 個(gè)共有色譜峰，其中峰 5、7、8、9、16 的峰面積相對(duì)較大。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果表明，不同批次的指紋圖譜與對(duì)照譜之間的相似度詳見(jiàn)表 2，相似度均在 0.980 以上，符合指紋圖譜的要求[52]。

8 0.997 0.998 0.989 0.990 0.999 0.999 0.989 1.000 0.999 0.989 09 0.997 0.998 0.993 0.993 0.999 0.999 0.992 0.999 1.000 0.993 00 0.991 0.995 0.985 0.988 0.990 0.993 0.998 0.989 0.993 1.000 0 0.996 0.995 0.998 0.998 0.997 0.998 0.998 0.995 0.998 0.998 13 肝豆湯的 UPLC 指紋圖譜建立和指認(rèn)S1～S10 共十個(gè)批次肝豆湯樣品供試液按照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行配制，“2.3.2”項(xiàng)下的 UPLC 色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，得到各樣品的 UPLC 色圖譜，對(duì)照品確認(rèn)出 9 個(gè)化合物，分別為鹽酸小檗堿，槲皮素，蘆薈大黃素，大黃奈素，姜黃素，大黃素，大黃酚和大黃素甲醚，詳見(jiàn)圖 3。選取保留時(shí)間和積穩(wěn)定且適中的共有峰（鹽酸小檗堿）作為參照峰（S 峰），將鹽酸小檗堿時(shí)間、峰面積設(shè)為 1，分別計(jì)算其他共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積見(jiàn)表 3、4。

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