【摘要】：目的:1.分離純化裂果薯皂苷,建立裂果薯甾體皂苷化合物的分離制備方法,并考察其對(duì)人肝癌細(xì)胞的抑制作用,確證裂果薯抗肝癌的具體成分。2.裂果薯甾體皂苷化合物Ⅰ(SPHSⅠ)和甾體皂苷化合物Ⅱ(SPHSⅡ)誘導(dǎo)人肝癌HepG2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡的作用并探討其作用機(jī)制。方法:1.80%乙醇常壓提取裂果薯塊莖,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取醇提物,正丁醇萃取部位經(jīng)D101大孔吸附樹(shù)脂富集皂苷,50%-95%的乙醇梯度洗脫;硅膠柱和Sephadex LH-20柱對(duì)75%乙醇組分進(jìn)行分離純化,得到裂果薯甾體皂苷化合物,采用NMR技術(shù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。同時(shí)采用MTT法觀(guān)察各組分對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用。2.MTT法和集落形成法觀(guān)察SPHSⅠ和SPHSⅡ?qū)epG2和SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制作用。Hoechst 33258法觀(guān)察SPHSⅠ和SPHSⅡ?qū)epG2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響。透射電鏡觀(guān)察SPHSⅠ和SPHSⅡ?qū)epG2和SMMC-7721細(xì)胞的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)形態(tài)特征。3.采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)SPHSⅠ和SPHSⅡ?qū)epG2和SMMC-7721細(xì)胞細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平和線(xiàn)粒體膜電位(MMP)的影響,N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理后再次測(cè)定上述指標(biāo)。Western blot(WB)法檢測(cè)SPHSⅠ和SPHSⅡ?qū)ep G2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和MAPK信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1.裂果薯醇提物、正丁醇部位、75%乙醇和95%乙醇組分能抑制SMMC-7721細(xì)胞的增殖,IC_(50)分別為92.35、56.26、5.69、5.49μg/mL。75%乙醇組分經(jīng)反復(fù)分離純化,得到裂果薯皂苷Ⅰ123.4 mg、裂果薯皂苷Ⅱ203.8 mg和豆甾醇苷546.8 mg;經(jīng)~1H NMR、~(13)C NMR分析,其結(jié)構(gòu)分別被確定為:(25S)-spirost-5-en-3β-yl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-O-[O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside、Yamogenin3-0-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside和stigmasterol 3-O-β-D-gIucopyranoside。2.SPHSⅠ顯著抑制HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的增殖,其24 h的IC_(50)為0.91和1.00μM;SPHSⅡ顯著抑制HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的增殖,其24 h的IC_(50)為0.57和0.56μM。集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SPHSⅠ和SPHSⅡ顯著抑制HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的增殖,呈濃度依賴(lài)性(P0.001)。Hoechst 33258染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)清晰完整,呈淡藍(lán)色熒光;給藥組可觀(guān)察到明顯的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,如形成凋亡小體等凋亡特征。透射電鏡結(jié)果顯示,空白對(duì)照組細(xì)胞膜和細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整;而給藥組細(xì)胞縮小,染色質(zhì)凝聚加深邊集于細(xì)胞膜及染色體固縮,產(chǎn)生大量的的凋亡小體等凋亡特征。流式凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SPHSⅠ和SPHSⅡ顯著誘導(dǎo)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞總凋亡率并呈濃度依賴(lài)性(P0.001)。流式周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SPHSⅠ和SPHSⅡ阻滯Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞于G2期,呈濃度依賴(lài)性(P0.001)。流式凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NAC能部分阻斷SPHSⅠ和SPHSⅡ?qū)epG2和SMMC-7721細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用,NAC+SPHSⅠ(或SPHSⅡ)組與SPHSⅠ(或SPHSⅡ)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。流式周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NAC能部分阻斷SPHSⅠ和SPHSⅡ?qū)ep G2和SMMC-7721細(xì)胞的周期阻滯作用,NAC+SPHSⅠ(或SPHSⅡ)組與SPHSⅠ(或SPHSⅡ)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。3.流式活性氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SPHSⅠ和SPHSⅡ能提高HepG2和SMMC-7721細(xì)胞的ROS,且呈濃度依賴(lài)性(P0.001)。流式線(xiàn)粒體膜電位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SPHSⅠ和SPHSⅡ能降低Hep G2和SMMC-7721細(xì)胞的MMP,且呈濃度依賴(lài)性(P0.001)。流式活性氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NAC能部分阻斷SPHSⅠ對(duì)HepG2和SMMC-7721細(xì)胞ROS的提高,NAC+SPHSⅠ組與SPHSⅠ組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。流式線(xiàn)粒體膜電位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NAC能部分阻斷SPHSⅠ和SPHSⅡ?qū)epG2和SMMC-7721細(xì)胞MMP的降低,NAC+SPHSⅠ(或SPHSⅡ)組與SPHSⅠ(或SPHSⅡ)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01或P0.05)。WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SPHSⅠ和SPHSⅡ作用HepG2和SMMC-7721細(xì)胞后能上調(diào)cleaved caspase-3、-8、-9、Cyto-C和Bax蛋白的表達(dá),下調(diào)Bcl-2和PARP蛋白的表達(dá);對(duì)MAPK相關(guān)蛋白的表達(dá)沒(méi)有影響,但是能顯著提高Erk、P38和JNK的磷酸化水平。結(jié)論:1.從裂果薯分離得到裂果薯甾體皂苷化合物Ⅰ、裂果薯甾體皂苷化合物Ⅱ和豆甾醇苷化合物,初步建立裂果薯甾體皂苷化合物Ⅰ和裂果薯甾體皂苷化合物Ⅱ的分離制備方法。2.SPHSⅠ和SPHSⅡ?qū)θ烁伟〩epG2和SMMC-7721細(xì)胞均具有增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用,其作用機(jī)制可能是通過(guò)ROS介導(dǎo)的線(xiàn)粒體途徑,并調(diào)控MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R284;R285
【圖文】：

56.6（C-14），32.2（C-15），81.2（C-16），62.7（C-17），16.3（C-1819.4（C-19），42.5（C-20），14.9（C-21），109.7（C-22），26.4（C-23），2（C-24），27.5（C-25），65.1（C-26），16.3（C-27），99.9（C-1 ），78.6（C-286.2（C-3 ），69.7（C-4 ），78.1（C-5 ），62.2（C-6 ），102.7（C-1 ），7（C-2 ），72.8（C-3 ），73.8（C-4 ），69.9（C-5 ），18.7（C-6 ），103.2（C-1 72.1（C-2 ），72.4（C-3 ），84.6（C-4 ），68.7（C-5 ），18.3（C-6 ）106.6（C-1 ），76.5（C-2 ），78.7（C-3 ），71.4（C-4 ），78.5（C-5 62.6（C-6 ）。裂果薯皂苷Ⅰ的1H NMR 數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值[20]基本一致，13C NM數(shù) 據(jù) 與 文 獻(xiàn) 值[20]完 全 一 致 。 NMR 分 析 結(jié) 果 表 明 ， 其 結(jié) 構(gòu) 為(25S)-spirost-5-en-3β-yl-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-O-[O-β-D-glucopyrosyl-(1→4)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside，分子式為C51H82O21，在此簡(jiǎn)稱(chēng)裂果薯皂苷Ⅰ（taccaoside Ⅰ），其分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖 1-

圖 1-3 裂果薯皂苷Ⅱ分子結(jié)構(gòu)式Fig1-3 The molecular structure of taccaoside Ⅱ豆甾醇苷分子結(jié)構(gòu)分析數(shù)據(jù)如下，1H NMR（500MHz，C5D5N）：，d，J =6.55Hz，H-21），0.65（3H，d，J =7.6Hz，H-27），0.97 =6.45Hz，H-27），0.86（3H，t，J =7.6Hz，H-29），3.95（1H，m，（1H，d，J =7.7Hz，H-1-GLc）。13C NMR（500MHz，C5D5N）：-1），34.2（C-2），78.1（C-3），37.0（C-4），141.0（C-5），122.0（C-7），32.2（C-8），51.5（C-9），36.4（C-10），21.4（C-11），40.9（C（C-13），56.9（C-14），25.6（C-15），29.4（C-16），56.1（C-17）-18），19.2（C-19），37.5（C-20），19.5（C-21），138.9（C-22），-23），46.1（C-24），29.5（C-25），21.3（C-26），19.0（C-27），24.6（C（C-29），102.6（C-1 ），71.7（C-2 ），78.7（C-3 ），75.4（C-4 ），

圖 1-4 豆甾醇苷分子結(jié)構(gòu)式Fig1-4 The molecular structure of stigmasterol glycosides薯各部位組份對(duì) SMMC-7721 細(xì)胞的增殖抑制作用驗(yàn)結(jié)果顯示，裂果薯乙醇提物能顯著抑制 SMMC-7721 細(xì)胞為 92.35 μg/mL。乙醇提物經(jīng)有機(jī)溶劑梯度萃取后，有效組部位，其 IC50為 56.26 μg/mL，比乙醇提物顯著降低。裂果薯 D101 大孔吸附樹(shù)脂富集后，乙醇梯度洗脫，其有效成分集中分、75%乙醇組分和 95%乙醇組分，IC50分別為 24.47、5.675%乙醇組分經(jīng)硅膠柱和葡聚糖凝膠 LH-20 色譜柱多次分到裂果薯皂苷Ⅰ、裂果薯皂苷Ⅱ和豆甾醇苷，由此建立了裂性成分（裂果薯皂苷Ⅰ和裂果薯皂苷Ⅱ）的分離純化方法。和裂果薯皂苷Ⅱ?qū)θ烁伟┘?xì)胞的增殖抑制作用結(jié)果詳見(jiàn)第二

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2774923