【摘要】：目的:基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究策略,探討“大戟-甘草”藥對(duì)配伍對(duì)H22肝癌腹水小鼠模型的影響及其作用機(jī)制,為中藥“十八反”“藻戟遂芫俱戰(zhàn)草”中“大戟反甘草”的配伍禁忌內(nèi)涵提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:采用H22肝癌腹水小鼠的動(dòng)物模型,研究“大戟-甘草”藥對(duì)對(duì)模型小鼠的影響及其作用機(jī)制。1.通過(guò)藥效學(xué)結(jié)果篩選“大戟-甘草”藥對(duì)的協(xié)同組及拮抗組:120只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為空白、模型、大戟與甘草不同配比(1:0.5、1:1、1:2和1:4)、大戟單煎和甘草單煎共8組,每組15只。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后,除空白組外,其他組小鼠均腹腔接種制備肝癌腹水模型。取腹水飽滿的H22肝癌瘤源鼠于超凈工作臺(tái),脫頸椎處死,固定于蠟板上,用碘酒及酒精消毒鼠腹,抽取腹水;將抽取的活體腹水細(xì)胞用生理鹽水按1:3稀釋,調(diào)整濃度(2×106個(gè)/mL瘤細(xì)胞),使存活率在95%以上;消毒小鼠腹部,用無(wú)菌注射器取0.3 mL稀釋的腹水,分別注入待造模小鼠腹腔,造模完成。造模當(dāng)天下午,各給藥組開(kāi)始灌胃給藥。大戟-甘草1:0.5組、1:1組、1:2組、1:4組分別灌胃大戟-甘草合煎液0.579、0.772、1.158、1.931 g/Kg/d;大戟組灌胃大戟煎液0.386 g/Kg/d;甘草組灌胃甘草煎液1.546 g/Kg/d。在該給藥劑量下,大戟給藥量為人臨床等效劑量的3 g�？瞻捉M與模型組每天給予等量的生理鹽水,連續(xù)給藥12天。7天后仍然沒(méi)有明顯腹圍增加的小鼠,即判定為造模失敗,去除。造模成功率為80%。第12天早上給藥,6小時(shí)后最后一次檢測(cè)各小鼠體重、腹圍、腹水量后摘除眼球取血,于4 ℃低溫離心機(jī)中,3000 rpm,離心15 min,分離血清,-80 ℃儲(chǔ)存用作血液生化指標(biāo)檢測(cè):抽取各小鼠腹水,記錄其腹水量,作為藥效學(xué)指標(biāo);于冰上取其腹膜組織于Trizol中,置于干冰中保存,用于全基因組表達(dá)譜檢測(cè);并取其肝腎組織,一部分肝腎組織置于4%多聚甲醛中固定,用于病理學(xué)檢測(cè),另一部分置于-80 ℃保存,用于后期實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。并以相同實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行第二批動(dòng)物實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證藥效學(xué)篩選結(jié)果。2.通過(guò)全基因組表達(dá)譜檢測(cè)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析,探索“大戟-甘草”藥對(duì)緩解肝癌腹水的機(jī)制。通過(guò)全基因組表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果篩選出:(1)與肝癌腹水疾病發(fā)生相關(guān)的基因集(模型組VS空白組);(2)與大戟單味藥緩解肝癌腹水藥效相關(guān)的基因集(大戟組VS模型組);(3)加入甘草后,促進(jìn)大戟緩解肝癌腹水藥效相關(guān)的基因集(協(xié)同組VS大戟組);(4)加入甘草后,拮抗大戟緩解肝癌腹水藥效相關(guān)的基因集(拮抗組VS大戟組)�；谏鲜鏊慕M基因間的相互作用信息,建立疾病-藥物多層次相互作用網(wǎng)絡(luò),通過(guò)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣饔?jì)算和各種功能通路富集分析,得到“大戟-甘草”藥對(duì)緩解肝癌腹水相關(guān)的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)。3.實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證:利用前期實(shí)驗(yàn)獲得的腎組織,通過(guò)Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證“大戟-甘草”藥對(duì)對(duì)前期篩選出的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)的蛋白質(zhì)及基因表達(dá)量的影響。再利用體外實(shí)驗(yàn)——小鼠腎集合管細(xì)胞(M-1)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。成果:1.“大戟-甘草”藥對(duì)對(duì)肝癌腹水小鼠藥效的影響實(shí)驗(yàn)研究表明,大戟單煎組(0.386 g/Kg/d)小鼠的體重、腹圍及腹水量等藥效學(xué)指標(biāo)顯著低于模型組,表明大戟具有一定的緩解肝癌腹水作用;當(dāng)大戟-甘草為1:2配伍時(shí)(1.158 g/Kg/d),上述藥效學(xué)指標(biāo)都顯著低于大戟單煎組,表明大戟與甘草1:2配伍時(shí),甘草能協(xié)同大戟發(fā)揮緩解肝癌腹水作用;當(dāng)大戟-甘草為1:4配伍時(shí)(1.931 g/Kg/d),上述藥效學(xué)指標(biāo)都顯著高于大戟單煎組,并與模型組小鼠無(wú)顯著性差異,表明大戟與甘草1:4配伍時(shí),甘草會(huì)拮抗大戟發(fā)揮緩解肝癌腹水作用。第二批動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與第一批結(jié)果一致。2.“大戟-甘草”藥對(duì)對(duì)肝癌腹水小鼠肝腎功能的影響實(shí)驗(yàn)研究表明,模型組與空白組相比,小鼠的肝腎指數(shù)(肝指數(shù)上升、腎指數(shù)下降),肝腎組織生化指標(biāo)(谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿肌酐、尿素氮等指標(biāo)上升)及肝腎組織病理學(xué)結(jié)果均顯示,肝癌腹水模型會(huì)致使小鼠肝腎功能及結(jié)構(gòu)損傷;各給藥組與模型組相比,小鼠的肝腎指數(shù)、肝腎組織生化指標(biāo)及肝腎組織病理學(xué)檢測(cè)均沒(méi)有顯著性差異,表明各給藥組不會(huì)對(duì)肝癌腹水模型小鼠的肝腎功能及結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著性改變,但有改善的趨勢(shì)。3.“大戟-甘草”藥對(duì)緩解肝癌腹水的機(jī)制研究基于各組小鼠腹膜組織的全基因組表達(dá)譜檢測(cè)結(jié)果,分別篩選得到:(1)與肝癌腹水疾病發(fā)生相關(guān)的靶標(biāo)基因:2252個(gè);(2)“大戟-甘草”藥對(duì)緩解肝癌腹水藥效的相關(guān)基因:86個(gè);(3)通過(guò)調(diào)研己知治療腹水藥物及其作用靶標(biāo):Avpr2。整合(1)(2)(3)部分,通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建模,根據(jù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的拓?fù)涮卣髦?節(jié)點(diǎn)連接度、節(jié)點(diǎn)介度、節(jié)點(diǎn)緊密度和k-core值),推測(cè)“大戟-甘草”藥對(duì)緩解肝癌腹水的作用機(jī)制可能與其對(duì)Frk-Arhgdib-Inpp5d-Avpr2-Aqp4信號(hào)軸的調(diào)節(jié)相關(guān)。4.“大戟-甘草”藥對(duì)緩解肝癌腹水作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基于肝癌腹水小鼠腎臟組織,采用Western blot和RT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組腎組織中的Frk、Arhgdib、Inpp5d、Avpr2和Aqp4蛋白質(zhì)和基因表達(dá)量均顯著上升;與模型組相比,大戟單煎組與大戟-甘草1:2藥效協(xié)同組小鼠腎組織中上述分子的蛋白質(zhì)和基因表達(dá)量均顯著降低,而大戟-甘草1:4藥效拮抗組中表達(dá)量均顯著升高;上述結(jié)果在基于體外培養(yǎng)小鼠腎集合管細(xì)胞(M-1)的實(shí)驗(yàn)中得以驗(yàn)證。結(jié)論:大戟具有一定的緩解肝癌腹水的作用,且甘草以不同比例配伍大戟時(shí),對(duì)肝癌腹水有不同影響作用:當(dāng)大戟-甘草以1:2配伍時(shí),甘草能協(xié)同大戟緩解肝癌腹水作用,當(dāng)大戟-甘草以1:4配伍時(shí),甘草會(huì)拮抗大戟的緩解肝癌腹水作用;其緩解肝癌腹水作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)Frk-Arhgdib-Inpp5d-Avpr2-Aqp4信號(hào)軸來(lái)實(shí)現(xiàn)的。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

驗(yàn)流程圖逡逑第二節(jié)實(shí)驗(yàn)材料逡逑一、數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件逡逑數(shù)據(jù)庫(kù)逡逑（１）邋Ｓｔｒｉｎｇ數(shù)據(jù)庫(kù)：生物分子相互作用信息數(shù)據(jù)庫(kù)，收集基因的相互作用信逡逑息，邋（ｖｅｒｓｉｏｎ邋１０，邋ｈｔｔｐ：／／ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ．ｏｒｇ／）邋0逡逑（２邋）邋ＤｒｕｇＢａｎｋ邋：查詢藥物對(duì)應(yīng)的耙標(biāo)信息，（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．邋ｄｒｕｇｂａｎｋ．邋ｃａ／，逡逑９逡逑

并且存在細(xì)胞擴(kuò)散和放大空置空間的情況；模型組小鼠的腎組織的異常變化存在于逡逑腎小球和腎小管。與模型組相比，大戟組和大戟－甘草協(xié)Ｍ組小鼠的病理切片結(jié)果顯逡逑示，能改善惡性肝癌腹水對(duì)肝腎組織的損害。結(jié)果見(jiàn)圖５。逡逑儒W畫逡逑圖５各組小鼠肝、腎組織病理切片情況逡逑第二節(jié)“大戟－甘草”藥對(duì)緩解小鼠肝癌腹水的機(jī)制研究結(jié)果逡逑一、與肝癌腹水生成相關(guān)基因的篩選逡逑根據(jù)全基因組表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析顯示：與正常對(duì)照組相比，肝癌腹水模型組小鼠逡逑的腹膜組織中共有２２５２個(gè)差異表達(dá)基因（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｇｅｎｅｓ，邋ＤＥＧｓ）逡逑（篩選條件：ｆｏｌｄ邋ｃｈａｎｇｅ邋＞２；尸〈０．０５邋），其中１４１８?jìng)�(gè)上調(diào)基因和８３４個(gè)下調(diào)逡逑２５逡逑

基因（部分見(jiàn)附錄２表Ｓ２）。因?yàn)槟Ｐ徒M是對(duì)空白組小鼠進(jìn)行腹腔注射腹水造模成逡逑功的肝癌腹水模型小鼠，所以這二者間的２２５２個(gè)差異基因我們認(rèn)為很可能是與肝癌逡逑腹水生成密切相關(guān)的關(guān)鍵差異基因。同時(shí)，分層聚類分析（圖６Ａ）和火山圖（圖６Ｂ）逡逑的特異表達(dá)基因顯示，模型組與空白組組間有很好的差異性。逡逑Ａ邐Ｍｏｄ邐Ｃｏｎ邐Ｂ逡逑：（逡逑－Ｔ邋Ｏ邋－？邋０邋－６邋０邋－４邋０邐＞０邋？邋？邋＊？邋■？邋Ｔ？逡逑Ｌｏｇ２ｔＦｏＭ邋Ｃｈａｎｇｅ邋（Ｃｏｎ邋ｙ？．邋？？ｏｄ）邐｜逡逑ｌＪ＾Ｉｂ逡逑圖６肝癌腹水模型組與正常組間所有特異性表達(dá)基因的分層聚類圖（６Ａ）和火逡逑山圖（６Ｂ）逡逑同時(shí)，通路富集分析結(jié)果表明，肝癌腹水小鼠組的上調(diào)基因與趨化因子信號(hào)通逡逑路（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝８．３４Ｅ＂＇１邋）、Ｆｃ伽馬Ｒ－介導(dǎo)的吞嗤作用（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ逡逑校正邋Ｐ值＝６．４８Ｅ＿ｌ）ｆｉ）、ＤＮＡ邋復(fù)制（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ邋校正邋Ｐ邋值＝３．邋５３ＥＨＢ邋）、Ｔｏｌｌ邋樣受體逡逑信號(hào)通路（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝９．邋７０邋Ｅ—＂ａ邋）、細(xì)胞周期（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝逡逑５．０２Ｅ＿ＩＭ邋）、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝０．０１邋）、細(xì)胞因子逡逑和細(xì)胞因子受體相互作用（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝０．邋０２邋）和Ｂ細(xì)胞受體信號(hào)通路逡逑（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ校正Ｐ值＝０．０３）等顯著相關(guān)

【參考文獻(xiàn)】

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1 孫丹妮;汪倩倩;王超;劉春芳;柳偉偉;林娜;;基于均勻設(shè)計(jì)法評(píng)價(jià)瓜蔞與制川烏反藥配伍組合的祛痰鎮(zhèn)咳作用[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2015年22期

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6 劉

本文編號(hào)：2774833