【摘要】：研究目的:卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,死亡率在婦科腫瘤中位居首位。順鉑和紫杉醇是卵巢癌的治療中最常用的化療藥物,最初治療時都會有比較好的療效,但是只有少部分的患者可被治愈,超過75%的病人仍會復發(fā)。復發(fā)的患者會從化療敏感轉(zhuǎn)化為化療耐受,導致治療效果不佳。所以,迫切需要尋找新的藥物用于卵巢癌的臨床治療。目前,中藥在抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域受到許多關(guān)注。有研究者從廣東民間常用的消腫止痛、抗腫瘤中藥中選出25種中藥,使用不同方法進行提取純化,發(fā)現(xiàn)重樓和地膽草的醇提物對鼻咽癌CNE1細胞的增殖抑制效果最佳。白花地膽草(Elephantopus mollis H.B.K.)為菊科地膽草屬植物,是我國長江以南地區(qū)最為常用的民間藥物。本課題組發(fā)現(xiàn)從白花地膽草中分離得到的倍半萜內(nèi)酯類單體EM-12對腫瘤細胞具有良好的增殖抑制效果,然而關(guān)于它的藥理學分子機制卻是未知的。所以,我們進一步探討EM-12對人卵巢癌細胞的促凋亡作用及其分子機制。研究方法:MTT實驗與克隆形成實驗檢測細胞增殖能力;臺酚藍染色法檢測細胞活性;RNA-Seq檢測轉(zhuǎn)錄組的變化;RT-qPCR檢測相關(guān)基因的mRNA水平;免疫印跡檢測相關(guān)蛋白的水平;透射電鏡檢測亞細胞超微結(jié)構(gòu);流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡水平;分子克隆構(gòu)建質(zhì)粒;脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染建立瞬時表達或敲低細胞株;分子對接預測藥物與蛋白的相互作用;免疫共沉淀技術(shù)檢測蛋白之間的結(jié)合;體外ATP酶活性測定實驗檢測ATP酶活性。研究結(jié)果:基于本課題組前期的研究結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)EM-12對鼻咽癌細胞具有較強的增殖抑制作用。因此我們推測EM-12對于卵巢癌細胞也具有良好的增殖抑制效果。通過MTT法檢測EM-12對于卵巢癌細胞的增殖抑制效果,我們發(fā)現(xiàn)EM-12可以顯著的抑制卵巢癌細胞的增殖,而對于正常卵巢上皮細胞增殖抑制效果不顯著。我們以A2780細胞為研究對象,進一步研究EM-12抑制卵巢癌細胞增殖的分子機制。通過RNA-Seq測序與GO功能分析,我們發(fā)現(xiàn)EM-12可以顯著激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導的內(nèi)源性凋亡通路。通過RT-qPCR與免疫印跡,我們發(fā)現(xiàn)未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)mRNA與蛋白水平被EM-12上調(diào),且相關(guān)蛋白發(fā)生磷酸化激活;通過透射電鏡檢測細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài),我們發(fā)現(xiàn)EM-12處理細胞后使得內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生膨脹。由此證明,EM-12的確誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。通過免疫印跡,我們發(fā)現(xiàn)EM-12處理細胞后BCL-2蛋白水平下調(diào),總的Caspase-9、Caspase-3蛋白水平減少,并且PARP出現(xiàn)切割。這說明EM-12的確可以誘導細胞凋亡。進一步地,敲低CHOP可以逆轉(zhuǎn)EM-12所誘導的細胞凋亡。由此證明,EM-12通過誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導細胞凋亡。接下來,我們探討EM-12誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子機制。BiP是熱休克蛋白HSP70家族的成員,它可以依靠NBD結(jié)構(gòu)域的ATP酶活性來發(fā)揮其分子伴侶的功能輔助蛋白質(zhì)的折疊;并且,BiP可以通過NBD結(jié)構(gòu)域與IRE1α、PERK、ATF6結(jié)合,抑制未折疊蛋白反應(yīng)通路的激活。所以,BiP在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)控中具有至關(guān)重要的作用。那么,我們猜測EM-12可能通過靶向BiP的NBD結(jié)構(gòu)域誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。所以,通過分子對接研究EM-12與BiP的相互作用,我們發(fā)現(xiàn)EM-12可以與BiP的NBD結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合;通過體外ATP酶活性的測定實驗發(fā)現(xiàn)EM-12的確可以抑制BiP的ATP酶活性;而通過免疫共沉淀實驗檢測,我們發(fā)現(xiàn)EM-12可以阻斷BiP與IRE1α、PERK的結(jié)合;由此證明,EM-12的確可以競爭性結(jié)合BiP的NBD結(jié)構(gòu)域,并且抑制其ATP酶活性,從而誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。既然,EM-12可以通過靶向BiP的NBD結(jié)構(gòu)域誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而介導內(nèi)源性凋亡導致卵巢癌細胞發(fā)生凋亡。那么,EM-12對于其他癌種的腫瘤細胞是否也具有相同的藥理作用?通過免疫印跡檢測未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)蛋白水平與流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡,我們發(fā)現(xiàn)EM-12對于肝癌、鼻咽癌、乳腺癌也具有相同的藥理作用。同時,我們發(fā)現(xiàn)EM-12對于紫杉醇耐藥的卵巢癌細胞也具有相同的促凋亡作用。結(jié)論:(1)EM-12可以通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導的內(nèi)源性凋亡通路誘導卵巢癌細胞凋亡。同時,EM-12對于正常卵巢上皮細胞的毒性較小。(2)EM-12通過靶向BiP的NBD結(jié)構(gòu)域誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。(3)EM-12可以通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導的內(nèi)源性凋亡通路誘導肝癌、乳腺癌、鼻咽癌、及對紫杉醇耐藥的卵巢癌細胞發(fā)生細胞凋亡。
【學位授予單位】：暨南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

究 EM-12 對人卵巢癌細胞的促凋亡作用及其分子機制。為 EM-12 將來應(yīng)用于床治療奠定實驗基礎(chǔ)。質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與未折疊蛋白反應(yīng)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum）是真核細胞中最大細胞器[24]。它主要的功能是的合成、加工、折疊、運輸，與分泌[25]。饑餓、缺氧、基因突變、鈣離子紊的超負荷等因素可以引起大量未折疊或者錯誤折疊的蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中堆積，導網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡及功能發(fā)生紊亂，這一過程被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER Stress，ERS）了存活，進化出一種針對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的反應(yīng)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時細胞內(nèi)的最認為是一種細胞保護機制，其目的在于恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，胞生存[27]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)（ER Stress Response）既要增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白質(zhì)和降解能力，又要降低進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)數(shù)量來減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的負擔。這些未折疊蛋白反應(yīng)（unfolding protein response, UPR）來完成[28]。

暨南大學碩士學位論文侶參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊與組裝，幫助未折疊及錯誤折疊的蛋白質(zhì)正確的折疊與組裝，或者使錯誤折疊及未折疊的蛋白進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑（ER-associated proteindegradation，ERAD），其在調(diào)節(jié)未折疊蛋白反應(yīng)上起著重要作用[29]。如圖 2 所示，在細胞處在未發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激或生理水平內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，BiP 通過它的 NBD 結(jié)構(gòu)域與IRE1α、PERK、ATF6 結(jié)合，抑制 IRE1α、PERK、ATF6 的激活；當細胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平上升時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白與錯誤折疊蛋白的累積，導致 BiP 從 IRE1α、PERK、ATF6解離下來，主動與未折疊蛋白發(fā)生結(jié)合，幫助它們進行正確折疊或者幫助它們進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑。解離后，三種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白 IRE1α、PERK、ATF6 激活，啟動未折疊蛋白反應(yīng)[30]。未折疊蛋白反應(yīng)可以通過以下 3 條通路激活：

圖 3：未折疊蛋白反應(yīng)與細胞存活（摘自：Guohui Wang, Zeng-Quan Yang, Kezhong Zhang, et al. Am J Transl Res. 2010）1.4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細胞凋亡細胞凋亡（apoptosis）是由基因控制的細胞自主、有序的死亡，它可以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[51]。其特征是細胞形態(tài)由正常形態(tài)開始變圓、變小，細胞核凝集破碎，胞質(zhì)皺縮內(nèi)陷，從而形成大量的凋亡小體[52]。細胞凋亡途徑主要有三種：死亡受體凋亡途徑、線粒體凋亡途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導的內(nèi)源性凋亡途徑。當細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平上升時，未折疊蛋白反應(yīng)致力于恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。如果，細胞處于過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)下，凋亡信號將被啟動。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導的凋亡有多種途徑，如 Caspase 依賴途徑、CHOP 依賴途徑等[53;54]。CHOP 依賴的凋亡途徑是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導致凋亡的主要通路[55;56]。當細胞發(fā)生強烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過激活未折疊蛋白反應(yīng)，誘導 CHOP 的表達，最終誘導細胞凋亡。

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8 余志英,周霞平,杜靜,張金超,羅軍,柯瑋琳;紫杉醇誘導卵巢癌細胞凋亡及基因調(diào)控的研究[J];華中科技大學學報(醫(yī)學版);2005年03期

9 仲任,黃瑞濱,宋善俊;組織因子途徑抑制物2對卵巢癌細胞遷徙和浸潤能力的影響(英文)[J];The Chinese-German Journal of Clinical Oncology;2005年01期

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5 任海軍;美找到卵巢癌易復發(fā)原因[N];大眾衛(wèi)生報;2009年

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8 胡德榮;發(fā)現(xiàn)卵巢癌生長新機制[N];健康報;2006年

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