【摘要】：目的:探討枳實(shí)對(duì)衣霉素誘導(dǎo)的Cajal間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78、ATF6的影響。方法:(1)采用酶解法分離原代大鼠胃間質(zhì)細(xì)胞(Interstitial cells of Cajal,ICCs),免疫熒光染色法鑒定ICCs細(xì)胞c-kit抗體;采用CCK-8法檢測不同濃度(0μg/ml、0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml)衣霉素(Tunicamycin,Tm)作用于ICCs不同時(shí)間(12h、24h、48h)對(duì)細(xì)胞活性的影響;qRT-PCR法檢測ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵分子GRP78 mRNA的表達(dá);透射電子顯微鏡觀察ICCs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)。(2)枳實(shí)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ICCs的影響:采用血清藥理學(xué)通法制備枳實(shí)含藥血清,抑制劑4-PBA阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。隨機(jī)將細(xì)胞分為:空白對(duì)照組(ICCs正常培養(yǎng))、Tm模型組(1μg/ml Tm處理ICCs)、4-PBA組(1μg/ml TM+10mM 4-PBA聯(lián)合作用)和枳實(shí)組(1μg/ml Tm+20%枳實(shí)含藥血清聯(lián)合作用),每組細(xì)胞均作用24h后用于檢測:采用透射電子顯微鏡觀察各組ICCs的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu);微板法測定各組ICCs的乳酸脫氫酶(LDH)活性;熒光酶標(biāo)儀測定各組ICCs的ROS水平;CCK-8法檢測各組ICCs的細(xì)胞活性;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察各組ICCs細(xì)胞的遷移修復(fù)能力;Elisa法、qRT-PCR法、Western blot法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78和ATF6的表達(dá)。結(jié)果:(1)光鏡下ICCs呈梭形、三角形、星型等,伴有細(xì)長的分枝狀突起,細(xì)胞質(zhì)較少,胞核大,與周圍細(xì)胞間形成突觸鏈接,免疫熒光染色法可見c-kit呈陽性表達(dá);采用CCK-8法檢測Tm對(duì)細(xì)胞活性的影響:當(dāng)Tm濃度為2μg/ml時(shí),Tm作用于ICCs 12h、24h、48h時(shí)細(xì)胞活性均降低,12h、24h、48h細(xì)胞活性(OD值)分別為0.553±0.026(P0.05)、0.466±0.046(P0.05)、0.164±0.034(P0.05);當(dāng)Tm濃度為1μg/ml,Tm作用于ICCs 24h、48h時(shí)細(xì)胞活性均降低,24h、48h細(xì)胞活性(OD值)分別為0.736±0.008(P0.05)、0.359±0.079(P0.05);qRT-RCR結(jié)果顯示:與0μg/ml Tm比較,1μg/ml Tm作用于ICCs 24h后,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵分子GRP78 mRNA表達(dá)升高,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);透射電子顯微鏡結(jié)果顯示:空白對(duì)照組ICCs培養(yǎng)24h后,細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)形態(tài)完整,排列整齊;1μg/ml Tm作用于ICCs 24h后,細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)腫脹、擴(kuò)張、斷裂、呈囊泡化、脫顆粒改變。(2)枳實(shí)對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ICCs的影響:透射電子顯微鏡結(jié)果顯示,空白對(duì)照組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)完好,Tm模型組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、擴(kuò)張、呈囊泡化、脫顆粒改變,4-PBA組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)斷裂、擴(kuò)張,枳實(shí)組ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、呈局限性擴(kuò)張;各組ICCs的LDH活性比較:與空白對(duì)照組比較,Tm模型組、4-PBA組、枳實(shí)組細(xì)胞LDH活性均升高(P0.05);與Tm模型組比較,4-PBA組、枳實(shí)組細(xì)胞LDH活性均降低(P0.05);各組ICCs的ROS含量比較:與空白對(duì)照組比較,Tm模型組、4-PBA組、枳實(shí)組細(xì)胞ROS含量均升高(P0.05);與Tm模型組比較,4-PBA組、枳實(shí)組細(xì)胞內(nèi)ROS含量均降低(P0.05);在倒置熒光顯微鏡下可見,Tm模型組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度較強(qiáng);而經(jīng)抑制劑、枳實(shí)含藥血清處理后細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度減弱;各組ICCs存活率比較:與空白對(duì)照組比較,其余各組ICCs的存活率均降低(P0.05);與Tm模型組比較,枳實(shí)組ICCs的存活率升高(P0.05);細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:相同時(shí)段內(nèi)ICCs組細(xì)胞間距隨著隨時(shí)間推移縮小。培養(yǎng)12h后,空白對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合率為(38.0±2.0)%、Tm模型組細(xì)胞劃痕愈合率為(19.7±4.5)%、4-PBA組細(xì)胞劃痕愈合率為(26.3±3.7)%、枳實(shí)組細(xì)胞劃痕愈合率為(30.0±2.0)%;培養(yǎng)24h后,空白對(duì)照組細(xì)胞劃痕愈合率為(31.0±2.0)%、Tm模型組細(xì)胞劃痕愈合率為(7.0±3.6)%、4-PBA組細(xì)胞劃痕愈合率為(35.7±2.1)%、枳實(shí)組細(xì)胞劃痕愈合率為(38.3±3.1)%;與Tm模型組相比,枳實(shí)組ICCs劃痕愈合率高(P0.05);Elisa法檢測各組細(xì)胞GRP78、ATF6蛋白含量結(jié)果顯示:與空白對(duì)照組比較,Tm模型組、4-PBA組、枳實(shí)組GRP78、ATF6蛋白含量均升高(P0.05);與Tm模型組比較,4-PBA組、枳實(shí)組的GRP78、ATF6蛋白含量均降低(P0.05);qRT-PCR法檢測GRP78、ATF6mRNA表達(dá)結(jié)果,與空白對(duì)照組比較,Tm模型、4-PBA組、枳實(shí)組GRP78、ATF6 mRNA表達(dá)均升高(P0.05);與Tm模型組比較,枳實(shí)組GRP78、ATF6 mRNA表達(dá)均降低(P0.05);與4-PBA組比較,枳實(shí)組GRP78 mRNA表達(dá)降低(P0.05);Western blot法檢測各組細(xì)胞GRP78、ATF6蛋白表達(dá)結(jié)果,與空白對(duì)照組比較,Tm模型組、4-PBA組、枳實(shí)組GRP78、ATF6蛋白表達(dá)均升高(P0.05);與Tm模型組比較,4-PBA組、枳實(shí)組的GRP78、ATF6表達(dá)均降低(P0.05)。結(jié)論:使用衣霉素成功構(gòu)建大鼠胃ICCs細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的模型;枳實(shí)可減輕由衣霉素誘導(dǎo)的ICCs內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷,提高受損細(xì)胞生長活性、改善細(xì)胞運(yùn)動(dòng)修復(fù)能力,這可能與其抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激ATF6通路有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

圖 1-1 ICCs 生長形態(tài)及免疫熒光鑒定（×100）Fig.1-1 Morphology and immunofluorescence identification of ICCs (×100).1.2 ICCs 細(xì)胞生長及形態(tài)觀察

2 不同培養(yǎng)時(shí)間的 ICCs 細(xì)胞形態(tài)2 The ICCs morphology at different culture timesculh 后 ICCs（×100） B 3d 后 ICCs（×100）eight hours later, ×100） ICCs（three days later, ×100）d 后 ICCs（×100） D 7d 后 ICCs（×100）five days later, ×100） ICCs（seven days later, ×100）構(gòu)建 ICCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激細(xì)胞模型1 Tm 對(duì) ICCs 活性的影響CCK8 結(jié)果顯示，當(dāng) Tm 濃度為 2μg/ml 時(shí)，ICCs 存活率顯著下降m 濃度升高，ICCs 存活率逐漸下降，而 Tm 濃度為 0μg/ml、0.125μgμg/ml、0.5μg/ml 時(shí)，各組細(xì)胞存活率無顯著差異。當(dāng) Tm 濃度為 1μg 24h、48h，細(xì)胞存活率均降低（P＜0.05），考慮到誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)

3.2.3 透射電子顯微鏡觀察 ICCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)變化結(jié)果如圖 1-3 所示，空白對(duì)照組 ICCs 內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)完整、排列整齊，如圖 1-3A；當(dāng) Tm 濃度為 1μg/ml Tm，作用于 ICCs24h 后，ICCs 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹、擴(kuò)張、呈囊泡化、相互離散及脫顆粒改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)破壞明顯，

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本文編號(hào)：2773712