發(fā)布時間：2020-07-28 14:56

【摘要】：目的:本研究通過全基因組表達譜檢測、網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)分析和實驗驗證相結(jié)合的方法,探究海藻玉壺湯(HYD)治療大鼠缺碘型甲狀腺腫大的作用機制,并揭示海藻-甘草反藥組合在此過程中的作用特點及其可能的作用機制,為中藥復方的研究提供一種新的研究思路和方法。方法:第一部分全基因組表達譜芯片檢測1缺碘型甲狀腺腫大大鼠動物模型1.1動物分組SPF級Wistar大鼠20只,雌雄各半,體重160-180 g。按照隨機均衡的原則,將其隨機分為空白組、模型組、海藻玉壺湯(HYD)組、去海藻(Non-HZ)組和去甘草(Non-GC)組,每組4只,適應性飼養(yǎng)2天。1.2造模及給藥除空白組外,其余各組灌服丙硫氧嘧啶(PTU)0.01 g/(kg.d),造模14天后開始給藥,其中空白組與模型組給予生理鹽水灌胃,HYD組、去海藻和去甘草組則給予相應藥液灌胃,給藥量0.9 g/(kg.d),連續(xù)給藥28天。每周稱重1次,自由攝食飲水。1.3樣本采集造模結(jié)束后,各組大鼠眼眶取血,采用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法檢測血清中T3、T4、TSH的含量。給藥結(jié)束后,各組大鼠腹主動脈取血,采用上述方法檢測血清中T3、T4、TSH的含量,此外,取甲狀腺組織,待全基因組表達譜芯片檢測。2各組大鼠甲狀腺組織全基因組表達譜芯片檢測采用基因表達譜芯片(ROA2.1)技術(shù),檢測各組大鼠甲狀腺組織的基因表達譜,并進行差異表達數(shù)據(jù)分析。最終獲得疾病及HYD藥效相關(guān)基因。第二部分網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)分析1 HYD相關(guān)作用靶標的整理首先從臺灣中醫(yī)藥資料庫,收集HYD中各味中藥所含化學成分的二級結(jié)構(gòu)信息�；谇捌诮⒌闹兴幇袠祟A測系統(tǒng)和所含化學成分的結(jié)構(gòu)相似性原理,預測HYD中各味中藥所含化學成分的候選靶標。將芯片檢測得到的HYD藥效相關(guān)基因與預測得到的該方候選靶標合并,作為本研究HYD相關(guān)作用靶標。2 HYD中各味中藥所含化學成分的含量測定采用液質(zhì)聯(lián)用的方法對HYD中各味中藥所含(與抗甲狀腺腫大藥效相關(guān)和網(wǎng)絡(luò)藥理學預測所得關(guān)鍵靶標對應)的化學成分進行含量測定。3已知治療甲狀腺腫大的靶標收集和整理從Drug Bank和KEGG數(shù)據(jù)庫中收集已知治療甲狀腺腫大靶標。4挖掘HYD治療大鼠缺碘型甲狀腺腫大的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標基于前期全基因組表達譜芯片檢測,獲得疾病相關(guān)的hub基因和HYD藥效相關(guān)的差異表達基因,通過網(wǎng)絡(luò)藥理學數(shù)據(jù)分析得到HYD預測靶標和已知治療甲狀腺腫大靶標,并構(gòu)建其相互作用網(wǎng)絡(luò)。5網(wǎng)絡(luò)拓撲特征值的計算計算每個基因節(jié)點的網(wǎng)絡(luò)拓撲特征值,包括節(jié)點連接度、緊密度、介度和邊介度值;篩選網(wǎng)絡(luò)中連接度大于連接度中位數(shù)兩倍的節(jié)點作為網(wǎng)絡(luò)中的高連接度基因(hubs),并構(gòu)建上述hubs直接相互作用網(wǎng)絡(luò);通過計算上述hubs網(wǎng)絡(luò)拓撲特征值,并提取上述四種拓撲特征值均大于相應中位數(shù)的節(jié)點作為重要hubs;對上述重要hubs進行生物學通路的富集分析,發(fā)現(xiàn)其中參與甲狀腺激素的合成通路的基因,即為HYD治療大鼠缺碘型甲狀腺腫大的關(guān)鍵靶標。此外,按照同樣方法獲得海藻-甘草藥對緩解大鼠缺碘型甲狀腺腫大的關(guān)鍵靶標。針對上述結(jié)果設(shè)計實驗進行驗證。第三部分實驗驗證1動物分組SPF級Wistar大鼠32只,雌雄各半,體重量160-180 g。按照隨機均衡的原則,將其隨機分為空白組、模型組、HYD組和去海藻甘草(Non-HZ/GC)組,每組8只,適應性飼養(yǎng)2天。2造模、給藥及取材造模、給藥、血清檢測及取材方法均參照前期動物實驗。最終取得甲狀腺組織,一部分甲狀腺組織迅速放入4%的多聚基甲醛中固定,進行常規(guī)脫水、包埋、切片、HE染色觀察甲狀腺組織的形態(tài)變化;另一部分甲狀腺組織置于凍存管中,液氮凍存。采用real-time PCR和western-blotting實驗方法驗證HYD對其候選靶標基因,包括兩種腺苷酸環(huán)化酶(Adcy1和Adcy2)、CAMP反應元件結(jié)合蛋白1(Creb1)、熱休克蛋白5(Hspa5)、人蛋白二硫異構(gòu)酶A4(Pdia4)、磷脂酶C、β1(Plcb1)、蛋白激酶的兩種亞型(Prkca和Prkcb)和甲狀腺過氧化物酶(Tpo)的調(diào)控作用。此外,采用相同方法驗證海藻-甘草反藥組合對HYD候選靶標基因,包括Adcy2、ATP酶的一種亞型(Atp1a2)、谷胱甘肽還原酶(Gsr)、碘化酪氨酸脫碘酶(Iyd)、Pdia4、Plcb1和甲狀腺球蛋白(Tg)的調(diào)控作用。結(jié)果:第一部分疾病及HYD藥效相關(guān)基因的篩選1動物模型的評價及HYD對缺碘型甲狀腺腫大大鼠藥效學評價造模結(jié)束后數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示,與空白組相比,其它各組大鼠血清中T3、T4含量均顯著降低(P0.05,P0.01),TSH含量均顯著升高(P0.01或P0.001),提示造模成功。HYD干預后,與模型組相比,大鼠血清中T3、T4含量均顯著升高(P0.05,P0.01),TSH含量、甲狀腺濕重及相對重量均顯著降低(P0.01,P0.05),然而,去海藻及去甘草組藥效并不顯著。提示HYD治療大鼠缺碘型甲狀腺腫大療效顯著,推測,海藻-甘草反藥組合在此過程中發(fā)揮著重要作用。2疾病相關(guān)hub基因及HYD藥效相關(guān)差異表達基因的篩選通過全基因組表達譜芯片檢測,獲得139個疾病相關(guān)hub基因和426個可能與HYD藥效相關(guān)的差異表達基因。第二部分HYD緩解缺碘型甲狀腺腫大關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標的挖掘1 HYD相關(guān)作用靶標的整理基于臺灣中醫(yī)藥資料庫,共收集565個HYD中各味中藥所含化學成分的二級結(jié)構(gòu)信息�；谇捌诮⒌闹兴幇袠祟A測系統(tǒng)和所含化學成分的結(jié)構(gòu)相似性原理預測得到該方142個候選靶標。將芯片檢測得到的HYD藥效相關(guān)的基因與上述候選靶標合并,作為本研究中HYD相關(guān)作用靶標,共632個靶標。2 HYD中各味中藥所含化學成分的含量測定采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),對HYD中所含中藥的22種化學成分進行含量測定。3已知治療甲狀腺腫大的靶標收集和整理從KEGG和Drug Bank數(shù)據(jù)庫中共收集到10個已知治療甲狀腺腫大的靶標。4挖掘HYD治療大鼠缺碘型甲狀腺腫大的關(guān)鍵網(wǎng)絡(luò)靶標構(gòu)建疾病相關(guān)hub基因、HYD相關(guān)作用靶標以及已知治療甲狀腺腫大靶標相互作用網(wǎng)絡(luò),并對網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點進行網(wǎng)絡(luò)拓撲特征值的計算,共得到77個重要hubs。對上述77個重要hubs進行生物學通路的富集分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有9個基因均參與甲狀腺激素的合成通路,并在其中發(fā)揮著重要作用;通過相同方法發(fā)現(xiàn),海藻-甘草反藥組合中有8個基因參與甲狀腺激素的合成通路。提示,HYD緩解缺碘型甲狀腺腫的作用機制可能是通過調(diào)節(jié)上述9個候選靶標,進而調(diào)控甲狀腺激素合成通路;海藻-甘草反藥組合則可能通過調(diào)控上述8個候選靶標組成的信號軸,進而調(diào)節(jié)甲狀腺激素的合成過程。第三部分HYD緩解大鼠缺碘型甲狀腺腫大潛在作用機制的實驗驗證1 HYD能緩解缺碘型甲狀腺腫大大鼠甲狀腺腫大的嚴重程度1.1 HYD對缺碘型甲狀腺腫大大鼠甲狀腺激素水平的影響與模型組相比,給予HYD治療后,大鼠血清中T3、T4含量均顯著升高(P0.05),TSH含量顯著降低(P0.01)。提示,HYD具有顯著治療大鼠缺碘型甲狀腺腫大的作用。1.2 HYD對缺碘型甲狀腺腫大大鼠甲狀腺濕重和相對重量的影響與空白組相比,模型組大鼠甲狀腺濕重及相對重量均顯著升高(P0.001);與模型組相比,HYD干預治療后,大鼠甲狀腺濕重及相對重量均顯著降低(P0.05,P0.01);與全方組相比較,拆方組大鼠甲狀腺相對重量顯著升高(P0.05)。提示,HYD具有顯著治療大鼠缺碘型甲狀腺腫大的作用,海藻-甘草藥對在此過程中發(fā)揮著重要作用。1.3 HYD對缺碘型甲狀腺腫大大鼠甲狀腺組織病理學的影響HE染色結(jié)果顯示,與空白組相比,甲狀腺腫大模型組大鼠甲狀腺組織大部分濾泡腔消失,濾泡上皮細胞明顯增高變形,濾泡周圍血管豐富。HYD干預治療后,這種情況可以得到明顯改善。2 HYD對其候選靶標基因的調(diào)控作用與空白組比,模型組大鼠甲狀腺組織中,除Hspa5和Pdia4兩個因子外,其它因子m RNA和蛋白的表達水平均顯著降低;與模型組比,全方給藥后,除Hspa5和Pdia4外,其它因子m RNA和蛋白的表達水平均顯著升高。3海藻-甘草反藥組合對HYD候選靶標的調(diào)控作用與空白組比,模型組大鼠甲狀腺組織中,除Pdia4因子外,其它因子m RNA和蛋白的表達水平均顯著降低;與模型組比,全方組大鼠甲狀腺組織中,除Pdia4外,其它因子m RNA和蛋白的表達水平均顯著升高;與全方組比,拆方組大鼠甲狀腺組織中Adcy2,Atp1a2和Tpo的m RNA和蛋白的表達水平均顯著降低。結(jié)論:本研究通過表達譜基因芯片的檢測結(jié)合藥物靶標預測、生物分子網(wǎng)絡(luò)分析和實驗驗證,闡釋HYD治療大鼠缺碘型甲狀腺腫大的作用機制。實驗結(jié)果表明,HYD具有改善大鼠缺碘型甲狀腺腫病情的作用,其作用可能與調(diào)節(jié)Adcy1、Adcy2和Tpo等候選靶標,進而調(diào)控甲狀腺激素合成通路有關(guān)。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),海藻-甘草反藥組合在HYD緩解大鼠缺碘型甲狀腺腫大的過程中發(fā)揮著重要作用。此項研究為中藥復方、中藥藥物組合等多組分藥物作用機制的研究提供方法學參考,有助于促進藥物開發(fā)和臨床應用。
【學位授予單位】：承德醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2773035