【摘要】：目的:結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)作為當(dāng)今世界發(fā)病率第三,致死率第四的惡性腫瘤,在2012年世界范圍內(nèi)的發(fā)病數(shù)達(dá)到了約136萬(wàn)例,而死亡數(shù)接近一半。雖然死亡率每年都會(huì)有所降低,但是發(fā)病率卻仍持續(xù)逐年上升,因此,化學(xué)預(yù)防是降低結(jié)直腸癌發(fā)病的重心。漢黃芩素是一類提取于唇形科植物黃芩根的黃酮類化合物,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化以及抗菌的作用。體外研究表明漢黃芩素能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng),并且可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。P53是目前已知的與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性最高的抑癌基因之一,其主要的功能是通過(guò)引起細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)以及誘導(dǎo)異常細(xì)胞凋亡來(lái)維持基因組和細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),從而對(duì)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到抑制作用。P53的亞細(xì)胞定位對(duì)腫瘤細(xì)胞的命運(yùn)會(huì)產(chǎn)生不同的影響,當(dāng)P53定位于細(xì)胞質(zhì)中時(shí)會(huì)抑制腫瘤細(xì)胞的自噬,而當(dāng)P53定位于細(xì)胞核中時(shí),會(huì)促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生自噬。基于目前的研究現(xiàn)狀,本文將利用AOM/DSS化學(xué)誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌模型來(lái)評(píng)價(jià)漢黃芩素對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防作用,并且結(jié)合體外細(xì)胞模型探索其抑制結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制。方法:1.漢黃芩素抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖,并且調(diào)節(jié)自噬與凋亡采用結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116與HT29細(xì)胞作為體外研究模型,經(jīng)過(guò)不同濃度的漢黃芩素(0-8Oμ M)處理72小時(shí)之后采用MTT法檢測(cè)漢黃芩素對(duì)兩種細(xì)胞的增殖抑制能力,根據(jù)MTT得到的IC50確定出后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥劑量,繼而采用平板克隆實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證漢黃芩素對(duì)這兩種細(xì)胞的克隆形成能力。然后通過(guò)蛋白免疫印跡法(Western blot)和流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry)檢測(cè)了漢黃芩素對(duì)HCT116與HT29結(jié)腸癌細(xì)胞自噬和凋亡的影響。2.漢黃零素調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平采用漢黃芩素處理HCT116與HT29細(xì)胞2小時(shí)之后收取細(xì)胞樣品,按照活性氧檢測(cè)試劑盒的操作步驟對(duì)細(xì)胞內(nèi)的活性氧進(jìn)行熒光染色標(biāo)記之后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞中活性氧的改變情況。3.漢黃芩素調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷由MTT法確定出后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥濃度,然后用所確定濃度的漢黃芩素處理HCT116與HT29結(jié)腸癌細(xì)胞72小時(shí),提取總蛋白,用Western blot技術(shù)來(lái)檢測(cè)漢黃芩素對(duì)這兩種細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷通路的影響,并采用Real-time PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中下游基因DDIT3和XBPI的表達(dá)水平。最后采用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)(彗星拖尾實(shí)驗(yàn))來(lái)觀察漢黃芩素對(duì)HCT116與HT29結(jié)腸癌細(xì)胞DNA損傷的影響。4.漢黃芩素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞P53核轉(zhuǎn)位的影響藥物處理HCT116與HT29結(jié)腸癌細(xì)胞后分別提取總蛋白以及胞漿胞核蛋白,采用Western blot技術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)總蛋白中P53核轉(zhuǎn)位相關(guān)的磷酸化P53蛋白水平,然后再分別檢測(cè)胞漿胞核蛋白中的磷酸化P53蛋白水平。最后,采用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察漢黃芩素對(duì)HCT116與HT29結(jié)腸癌細(xì)胞P53核轉(zhuǎn)位相關(guān)的磷酸化蛋白表達(dá)水平的影響。5.漢黃芩素對(duì)AOM/DSS化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的預(yù)防作用研究本章節(jié)采用AOM/DSS誘導(dǎo)的炎癥性結(jié)直腸癌的動(dòng)物模型,漢黃芩素給藥處理20周,考察漢黃芩素對(duì)結(jié)直腸癌形成和發(fā)展過(guò)程中的化學(xué)預(yù)防作用。造模期間定期記錄動(dòng)物體重,觀察動(dòng)物狀態(tài),以便評(píng)估漢黃芩素對(duì)動(dòng)物是否有毒性。在實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí),統(tǒng)計(jì)每組小鼠的腫瘤發(fā)生率和結(jié)腸長(zhǎng)度,采用Western blot法檢測(cè)自噬、凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。6.統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件來(lái)進(jìn)行,采用One way ANOVA來(lái)比較多個(gè)處理組之間的均數(shù),P0.05表示處理組之間具有顯著性差異。采用GraphPad 5.0數(shù)據(jù)分析軟件作圖,數(shù)據(jù)結(jié)果以Mean 土 SD表示。結(jié)果:1.漢黃岑素顯著抑制HCT116和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,并且對(duì)這兩種結(jié)腸癌細(xì)胞的自噬和凋亡產(chǎn)生不同的作用經(jīng)漢黃芩素給藥72小時(shí)之后,漢黃芩素在這兩種細(xì)胞上的IC50分別為70.14 14μM和117.9 μM,10μ M的漢黃芩素即可對(duì)HCT116和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生明顯的抑制作用。經(jīng)過(guò)平板克隆實(shí)驗(yàn)我們觀察到漢黃芩素對(duì)HCT116和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞克隆形成能力均有明顯的抑制作用。與此同時(shí),漢黃芩素抑制了 HCT116細(xì)胞的自噬,誘導(dǎo)其產(chǎn)生凋亡。相反地,漢黃芩素處理72小時(shí)能夠顯著地促進(jìn)HT29細(xì)胞的自噬,但是漢黃芩素處理24小時(shí)之后卻能夠抑制到HT29細(xì)胞的凋亡。2.漢黃芩素刺激HCT116細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,而抑制HT29細(xì)胞內(nèi)活性氧的釋放漢黃芩素處理HCT116和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞2小時(shí)之后收取細(xì)胞樣品,經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),漢黃芩素能誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn),相對(duì)于對(duì)照組其細(xì)胞內(nèi)活性氧染料熒光的百分比顯著增加,而經(jīng)過(guò)還原劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理后,HCT116細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平顯著降低;然而在HT29細(xì)胞中,漢黃芩素處理兩個(gè)小時(shí)之后抑制了細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。3.漢黃芩素能夠促進(jìn)HCT116內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷,抑制HT29內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷HCT116和HT29結(jié)腸癌細(xì)胞給予漢黃芩素處理72小時(shí)之后檢測(cè)藥物對(duì)這兩種細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷的影響水平。結(jié)果顯示,漢黃芩素能夠誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,顯著上調(diào)該通路相關(guān)蛋白以及下游靶基因DDIT3和XBP1表達(dá)水平;漢黃芩素作用于HT29后抑制其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用,顯著下調(diào)該通路相關(guān)蛋白表達(dá)量,以及其下游靶基因DDIT3和XBP1的表達(dá)水平。與此同時(shí),漢黃芩素能夠誘導(dǎo)HCCT116細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷,激活該通路相關(guān)蛋白,單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)也顯示出細(xì)胞出現(xiàn)較長(zhǎng)的拖尾現(xiàn)象;漢黃芩素作用于HT29之后抑制了其DNA損傷作用,與該通路相關(guān)蛋白表達(dá)量有所下調(diào),單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)未觀察到細(xì)胞出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。4.漢黃等素促進(jìn)了 p53在HCT116細(xì)胞中的胞漿定位,促進(jìn)了 p53在HT29細(xì)胞中的胞核定位。在HCT116細(xì)胞的總蛋白中,漢黃芩素作用后可以顯著增加p-p53(ser315)和p-p53(ser376)的水平,而且細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,漢黃芩素可以促進(jìn)p-p53(ser15)在細(xì)胞質(zhì)中積累,增加p53在HCT116細(xì)胞中的胞漿定位。在HT29細(xì)胞的總蛋白中,漢黃岑1素降低p-p53(ser315)和p-p53(ser376)的水平,而且細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,漢黃芩素可以促進(jìn)p-p53(ser15)在細(xì)胞核中的積累,促使P53在HT29細(xì)胞中的胞核定位。5.漢黃芩素體內(nèi)化學(xué)預(yù)防結(jié)直腸癌作用的機(jī)制在由AOM/DSS誘導(dǎo)的炎癥性結(jié)直腸癌動(dòng)物模型中,漢黃芩素能夠顯著地降低結(jié)直腸癌的發(fā)生率。在持續(xù)二十周的給藥之后,各組小鼠之間的體重并未出現(xiàn)明顯的差異,并且在給藥之后由炎癥引起的結(jié)腸縮短也得到了很好地恢復(fù)。此外,給藥之后動(dòng)物體內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷均上調(diào),并且自噬水平顯著降低,凋亡細(xì)胞顯著升高。結(jié)論:本課題采用體外結(jié)腸癌細(xì)胞和AOM/DSS誘導(dǎo)的炎癥性結(jié)直腸癌動(dòng)物模型來(lái)探討了漢黃芩素對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)防的作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩素能夠影響ROS產(chǎn)生,調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷通路,進(jìn)而對(duì)p53的核轉(zhuǎn)位功能產(chǎn)生影響,最終通過(guò)凋亡或自噬通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。在HCT116細(xì)胞中,漢黃芩素能夠促使p53在細(xì)胞質(zhì)中定位,進(jìn)而對(duì)自噬產(chǎn)生抑制作用;而在HT29細(xì)胞中漢黃芩素能夠誘導(dǎo)p53定位于胞核,進(jìn)而對(duì)自噬產(chǎn)生促進(jìn)作用。因此,本研究為漢黃芩素對(duì)結(jié)直腸癌的化學(xué)預(yù)防提供了一個(gè)新的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

齡的升高而增加。在大部分的發(fā)達(dá)國(guó)家之中，結(jié)直腸癌的發(fā)病中位年齡約為７０歲。逡逑結(jié)直腸癌的發(fā)病率在我國(guó)雖然不高，但是其呈現(xiàn)出一種上升的趨勢(shì)？。全球每年約有逡逑８０萬(wàn)人死于結(jié)直腸癌，而我國(guó)的結(jié)直腸癌發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)均占全球第一（圖１．１）。逡逑我國(guó)人口老齡化情況日益加重，并且由工業(yè)化進(jìn)程導(dǎo)致的環(huán)境污染使得結(jié)直腸癌的發(fā)逡逑生率無(wú)論是在農(nóng)村還是城市均逐年升高，阮麗琴等人通過(guò)對(duì)２３８４例結(jié)直腸癌患者的逡逑臨床資料統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)在不同的年齡組中男性的發(fā)病率均高于女性；在青年患者組＃逡逑中，男女患病比例為１．６７：１，隨著年齡的增長(zhǎng)，該比例有所下降，在老年患者組中的逡逑發(fā)病比例降低為１．２９：ｌｔ２５］。此外，從地域的角度來(lái)看，在我國(guó)東部沿海發(fā)達(dá)地區(qū)結(jié)直逡逑腸癌的發(fā)病率明顯高于內(nèi)地，例如上海地區(qū)的結(jié)直腸癌發(fā)病率已經(jīng)躍居到了第二位，逡逑這提示我們結(jié)直腸癌的發(fā)生或許與西式化的飲食以及生活方式的改變也有一定的關(guān)＿逡逑系。結(jié)直腸癌的高發(fā)不僅會(huì)對(duì)患者的生理和心理造成極大的痛苦，更會(huì)對(duì)社會(huì)的平穩(wěn)逡逑健康發(fā)展產(chǎn)生嚴(yán)重的阻礙作用，因此如何降低結(jié)直腸癌的發(fā)生率以及提高治療效率己１逡逑經(jīng)成為全球范圍性的關(guān)注問題。逡逑１．２結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)理逡逑有研宄表明

BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作以及蛋白樣品定量流程圖

圖２．邋２邋ＢＳＡ標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)曲

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2772942