發(fā)布時間：2020-07-28 13:26

【摘要】：目的:結(jié)直腸癌(Colorectal cancer,CRC)作為當今世界發(fā)病率第三,致死率第四的惡性腫瘤,在2012年世界范圍內(nèi)的發(fā)病數(shù)達到了約136萬例,而死亡數(shù)接近一半。雖然死亡率每年都會有所降低,但是發(fā)病率卻仍持續(xù)逐年上升,因此,化學預(yù)防是降低結(jié)直腸癌發(fā)病的重心。漢黃芩素是一類提取于唇形科植物黃芩根的黃酮類化合物,據(jù)文獻報道,其具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化以及抗菌的作用。體外研究表明漢黃芩素能夠抑制腫瘤細胞的增殖和生長,并且可以誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。P53是目前已知的與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)性最高的抑癌基因之一,其主要的功能是通過引起細胞周期阻滯、DNA修復(fù)以及誘導(dǎo)異常細胞凋亡來維持基因組和細胞的穩(wěn)態(tài),從而對腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起到抑制作用。P53的亞細胞定位對腫瘤細胞的命運會產(chǎn)生不同的影響,當P53定位于細胞質(zhì)中時會抑制腫瘤細胞的自噬,而當P53定位于細胞核中時,會促進細胞產(chǎn)生自噬�；谀壳暗难芯楷F(xiàn)狀,本文將利用AOM/DSS化學誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸癌模型來評價漢黃芩素對結(jié)直腸癌的化學預(yù)防作用,并且結(jié)合體外細胞模型探索其抑制結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的作用機制。方法:1.漢黃芩素抑制結(jié)直腸癌細胞增殖,并且調(diào)節(jié)自噬與凋亡采用結(jié)腸癌細胞HCT116與HT29細胞作為體外研究模型,經(jīng)過不同濃度的漢黃芩素(0-8Oμ M)處理72小時之后采用MTT法檢測漢黃芩素對兩種細胞的增殖抑制能力,根據(jù)MTT得到的IC50確定出后續(xù)實驗的給藥劑量,繼而采用平板克隆實驗來驗證漢黃芩素對這兩種細胞的克隆形成能力。然后通過蛋白免疫印跡法(Western blot)和流式細胞術(shù)(Flow cytometry)檢測了漢黃芩素對HCT116與HT29結(jié)腸癌細胞自噬和凋亡的影響。2.漢黃零素調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞內(nèi)的活性氧水平采用漢黃芩素處理HCT116與HT29細胞2小時之后收取細胞樣品,按照活性氧檢測試劑盒的操作步驟對細胞內(nèi)的活性氧進行熒光染色標記之后采用流式細胞儀檢測細胞中活性氧的改變情況。3.漢黃芩素調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷由MTT法確定出后續(xù)實驗的給藥濃度,然后用所確定濃度的漢黃芩素處理HCT116與HT29結(jié)腸癌細胞72小時,提取總蛋白,用Western blot技術(shù)來檢測漢黃芩素對這兩種細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷通路的影響,并采用Real-time PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路中下游基因DDIT3和XBPI的表達水平。最后采用單細胞凝膠電泳實驗(彗星拖尾實驗)來觀察漢黃芩素對HCT116與HT29結(jié)腸癌細胞DNA損傷的影響。4.漢黃芩素對結(jié)腸癌細胞P53核轉(zhuǎn)位的影響藥物處理HCT116與HT29結(jié)腸癌細胞后分別提取總蛋白以及胞漿胞核蛋白,采用Western blot技術(shù)檢測藥物對總蛋白中P53核轉(zhuǎn)位相關(guān)的磷酸化P53蛋白水平,然后再分別檢測胞漿胞核蛋白中的磷酸化P53蛋白水平。最后,采用細胞免疫熒光實驗來觀察漢黃芩素對HCT116與HT29結(jié)腸癌細胞P53核轉(zhuǎn)位相關(guān)的磷酸化蛋白表達水平的影響。5.漢黃芩素對AOM/DSS化學誘導(dǎo)結(jié)直腸癌動物模型的預(yù)防作用研究本章節(jié)采用AOM/DSS誘導(dǎo)的炎癥性結(jié)直腸癌的動物模型,漢黃芩素給藥處理20周,考察漢黃芩素對結(jié)直腸癌形成和發(fā)展過程中的化學預(yù)防作用。造模期間定期記錄動物體重,觀察動物狀態(tài),以便評估漢黃芩素對動物是否有毒性。在實驗終點時,統(tǒng)計每組小鼠的腫瘤發(fā)生率和結(jié)腸長度,采用Western blot法檢測自噬、凋亡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷相關(guān)蛋白的表達水平。6.統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件來進行,采用One way ANOVA來比較多個處理組之間的均數(shù),P0.05表示處理組之間具有顯著性差異。采用GraphPad 5.0數(shù)據(jù)分析軟件作圖,數(shù)據(jù)結(jié)果以Mean 土 SD表示。結(jié)果:1.漢黃岑素顯著抑制HCT116和HT29結(jié)腸癌細胞的增殖,并且對這兩種結(jié)腸癌細胞的自噬和凋亡產(chǎn)生不同的作用經(jīng)漢黃芩素給藥72小時之后,漢黃芩素在這兩種細胞上的IC50分別為70.14 14μM和117.9 μM,10μ M的漢黃芩素即可對HCT116和HT29結(jié)腸癌細胞產(chǎn)生明顯的抑制作用。經(jīng)過平板克隆實驗我們觀察到漢黃芩素對HCT116和HT29結(jié)腸癌細胞克隆形成能力均有明顯的抑制作用。與此同時,漢黃芩素抑制了 HCT116細胞的自噬,誘導(dǎo)其產(chǎn)生凋亡。相反地,漢黃芩素處理72小時能夠顯著地促進HT29細胞的自噬,但是漢黃芩素處理24小時之后卻能夠抑制到HT29細胞的凋亡。2.漢黃芩素刺激HCT116細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,而抑制HT29細胞內(nèi)活性氧的釋放漢黃芩素處理HCT116和HT29結(jié)腸癌細胞2小時之后收取細胞樣品,經(jīng)過流式細胞儀檢測后發(fā)現(xiàn),漢黃芩素能誘導(dǎo)HCT116細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,經(jīng)過統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn),相對于對照組其細胞內(nèi)活性氧染料熒光的百分比顯著增加,而經(jīng)過還原劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)處理后,HCT116細胞內(nèi)的活性氧水平顯著降低;然而在HT29細胞中,漢黃芩素處理兩個小時之后抑制了細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生。3.漢黃芩素能夠促進HCT116內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷,抑制HT29內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷HCT116和HT29結(jié)腸癌細胞給予漢黃芩素處理72小時之后檢測藥物對這兩種細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷的影響水平。結(jié)果顯示,漢黃芩素能夠誘導(dǎo)HCT116細胞產(chǎn)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,顯著上調(diào)該通路相關(guān)蛋白以及下游靶基因DDIT3和XBP1表達水平;漢黃芩素作用于HT29后抑制其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用,顯著下調(diào)該通路相關(guān)蛋白表達量,以及其下游靶基因DDIT3和XBP1的表達水平。與此同時,漢黃芩素能夠誘導(dǎo)HCCT116細胞產(chǎn)生DNA損傷,激活該通路相關(guān)蛋白,單細胞凝膠電泳實驗也顯示出細胞出現(xiàn)較長的拖尾現(xiàn)象;漢黃芩素作用于HT29之后抑制了其DNA損傷作用,與該通路相關(guān)蛋白表達量有所下調(diào),單細胞凝膠電泳實驗未觀察到細胞出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。4.漢黃等素促進了 p53在HCT116細胞中的胞漿定位,促進了 p53在HT29細胞中的胞核定位。在HCT116細胞的總蛋白中,漢黃芩素作用后可以顯著增加p-p53(ser315)和p-p53(ser376)的水平,而且細胞免疫熒光實驗結(jié)果表明,漢黃芩素可以促進p-p53(ser15)在細胞質(zhì)中積累,增加p53在HCT116細胞中的胞漿定位。在HT29細胞的總蛋白中,漢黃岑1素降低p-p53(ser315)和p-p53(ser376)的水平,而且細胞免疫熒光實驗的結(jié)果顯示,漢黃芩素可以促進p-p53(ser15)在細胞核中的積累,促使P53在HT29細胞中的胞核定位。5.漢黃芩素體內(nèi)化學預(yù)防結(jié)直腸癌作用的機制在由AOM/DSS誘導(dǎo)的炎癥性結(jié)直腸癌動物模型中,漢黃芩素能夠顯著地降低結(jié)直腸癌的發(fā)生率。在持續(xù)二十周的給藥之后,各組小鼠之間的體重并未出現(xiàn)明顯的差異,并且在給藥之后由炎癥引起的結(jié)腸縮短也得到了很好地恢復(fù)。此外,給藥之后動物體內(nèi)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷均上調(diào),并且自噬水平顯著降低,凋亡細胞顯著升高。結(jié)論:本課題采用體外結(jié)腸癌細胞和AOM/DSS誘導(dǎo)的炎癥性結(jié)直腸癌動物模型來探討了漢黃芩素對結(jié)直腸癌預(yù)防的作用機制。研究發(fā)現(xiàn)漢黃芩素能夠影響ROS產(chǎn)生,調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和DNA損傷通路,進而對p53的核轉(zhuǎn)位功能產(chǎn)生影響,最終通過凋亡或自噬通路誘導(dǎo)細胞死亡。在HCT116細胞中,漢黃芩素能夠促使p53在細胞質(zhì)中定位,進而對自噬產(chǎn)生抑制作用;而在HT29細胞中漢黃芩素能夠誘導(dǎo)p53定位于胞核,進而對自噬產(chǎn)生促進作用。因此,本研究為漢黃芩素對結(jié)直腸癌的化學預(yù)防提供了一個新的理論依據(jù)。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285
【圖文】：

齡的升高而增加。在大部分的發(fā)達國家之中，結(jié)直腸癌的發(fā)病中位年齡約為７０歲。逡逑結(jié)直腸癌的發(fā)病率在我國雖然不高，但是其呈現(xiàn)出一種上升的趨勢？。全球每年約有逡逑８０萬人死于結(jié)直腸癌，而我國的結(jié)直腸癌發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)均占全球第一（圖１．１）。逡逑我國人口老齡化情況日益加重，并且由工業(yè)化進程導(dǎo)致的環(huán)境污染使得結(jié)直腸癌的發(fā)逡逑生率無論是在農(nóng)村還是城市均逐年升高，阮麗琴等人通過對２３８４例結(jié)直腸癌患者的逡逑臨床資料統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn)在不同的年齡組中男性的發(fā)病率均高于女性；在青年患者組＃逡逑中，男女患病比例為１．６７：１，隨著年齡的增長，該比例有所下降，在老年患者組中的逡逑發(fā)病比例降低為１．２９：ｌｔ２５］。此外，從地域的角度來看，在我國東部沿海發(fā)達地區(qū)結(jié)直逡逑腸癌的發(fā)病率明顯高于內(nèi)地，例如上海地區(qū)的結(jié)直腸癌發(fā)病率已經(jīng)躍居到了第二位，逡逑這提示我們結(jié)直腸癌的發(fā)生或許與西式化的飲食以及生活方式的改變也有一定的關(guān)＿逡逑系。結(jié)直腸癌的高發(fā)不僅會對患者的生理和心理造成極大的痛苦，更會對社會的平穩(wěn)逡逑健康發(fā)展產(chǎn)生嚴重的阻礙作用，因此如何降低結(jié)直腸癌的發(fā)生率以及提高治療效率己１逡逑經(jīng)成為全球范圍性的關(guān)注問題。逡逑１．２結(jié)直腸癌的發(fā)病機理逡逑有研宄表明

BSA標準曲線的制作以及蛋白樣品定量流程圖

圖２．邋２邋ＢＳＡ標準標曲

【參考文獻】

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本文編號：2772942