【摘要】：食藥兩用的荷葉離褶傘菌(Lyophyllum decastes(Fr.:Fr.)Sing)為白蘑科離褶傘屬真菌,研究發(fā)現(xiàn)從荷葉離褶傘菌中提取出的多糖可參與多種生物活動(dòng)。目前對(duì)荷葉離褶傘菌的研究主要集中在提取出的粗多糖體外刺激細(xì)胞參與免疫反應(yīng),對(duì)荷葉離褶傘菌多糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)暫無(wú)相關(guān)報(bào)道,同時(shí)缺乏系統(tǒng)性地研究荷葉離褶傘菌多糖體內(nèi)外刺激細(xì)胞參與免疫反應(yīng)的作用機(jī)制。本研究從采自四川省小金縣的荷葉離褶傘菌中提取得到較高純度的多糖,并對(duì)其精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行相關(guān)性研究,同時(shí)對(duì)提取出的荷葉離褶傘菌多糖體內(nèi)外生物學(xué)活性進(jìn)行系統(tǒng)性分析,希望能進(jìn)一步了解具高效生物學(xué)活性的荷葉離褶傘菌多糖結(jié)構(gòu)及其免疫作用機(jī)制。本論文主要研究結(jié)果如下:(1)采用轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列分析法和形態(tài)比對(duì)法鑒定荷葉離褶傘菌的分類學(xué)地位。確定該菌種為荷葉離褶傘菌(Lyophyllum decastes(Fr.:Fr.)Sing)。(2)以荷葉離褶傘菌子實(shí)體作為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)熱水浸提法、醇沉法、DEAE cellulose-52色譜和DEAE-FF凝膠色譜層析法、超凈水透析法分離純化多糖,獲得荷葉離褶傘多糖(LDS-1)。最后,通過(guò)高效凝膠滲透色譜法(HPLC-RID)測(cè)得荷葉離褶傘多糖(LDS-1)是重均分子量(Mw)為8681 Da的均一多糖。(3)利用FT-IR、HPLC-RID、~1H-NMR、~(13)C-NMR、HMQC、HMBC、~1H-~1H COSY、GC-MS分析LDS-1的精細(xì)結(jié)構(gòu),荷葉離褶傘多糖的糖單元結(jié)構(gòu)是以比例為2:1的葡萄糖殘基和半乳糖殘基組成,并以1,4-α-葡萄糖殘基為主鏈,其中一個(gè)葡萄糖殘基的6-O位上連接支鏈,支鏈由兩個(gè)β-半乳糖殘基組成,以1,6-連接的方式結(jié)合,其中一個(gè)半乳糖殘基的C1位上連接主鏈,6-O位上連接另一個(gè)半乳糖殘基。(4)檢測(cè)LDS-1在所設(shè)的濃度范圍內(nèi)對(duì)T細(xì)胞、B細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)活性的影響,結(jié)果顯示LDS-1對(duì)免疫細(xì)胞的增殖具有顯著促進(jìn)作用。檢測(cè)LDS-1在所設(shè)的濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞分泌免疫因子的影響,結(jié)果顯示LDS-1促進(jìn)IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、TNF-α、TNF1-β、IL-2的分泌,其中IgE的最高分泌率為46.22%。通過(guò)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞吞噬中性紅和熒光微球,結(jié)果顯示在所設(shè)的濃度范圍內(nèi)測(cè)得LDS-1促進(jìn)RAW264.7吞噬,其中中性紅的吞噬率高達(dá)60.67%。檢測(cè)LDS-1在所設(shè)的濃度范圍內(nèi)對(duì)CT26.WT、MFC、L929、S180腫瘤細(xì)胞增殖的影響,結(jié)果顯示LDS-1能抑制各腫瘤細(xì)胞的增殖,抑制率最高可達(dá)45.01%。建立S180腫瘤小鼠模型,測(cè)得LDS-1的腫瘤抑制率為54.32%。(5)通過(guò)對(duì)小鼠S180腫瘤組織轉(zhuǎn)錄組分析,發(fā)現(xiàn)LDS-1在MAPK途徑中主要通過(guò)下調(diào)creb、cd14、traf6、ikk、nfκb等基因,減少DNA的表達(dá)量,抑制腫瘤細(xì)胞增殖和分化、抗老化。LDS-1在Ras信號(hào)通路中,下調(diào)rassf1、nore1、mst1、pak、rac、ikk、nfκb等基因,負(fù)調(diào)控細(xì)胞周期,抑制腫瘤細(xì)胞的侵染和轉(zhuǎn)移。在PI3K-Akt信號(hào)通路中,下調(diào)基因egf、ras、raf1、pkcs、creb、ikk、nfκb介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞DNA的修復(fù),降低細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量,間接調(diào)控腫瘤細(xì)胞的存活量。LDS-1在細(xì)胞循環(huán)、Wnt信號(hào)通路、細(xì)胞核區(qū)域中通過(guò)上調(diào)p15ink4b、wnt、fzd、c/ebpα、pdgf、IkBα等基因,負(fù)調(diào)控腫瘤細(xì)胞細(xì)胞周期,抑制腫瘤細(xì)胞逃避凋亡和分化。綜上結(jié)果,可知荷葉離褶傘菌多糖(LDS-1)為新穎性多糖,具有促免疫抗腫瘤的作用,為其食藥應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：西華師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R284;R285.5
【圖文】：

荷葉離褶傘菌的rDNA-ITSPCR產(chǎn)物

野生型荷葉離褶傘菌的ITS序列

基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的野生荷葉離褶傘菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2772881