【摘要】：目的:初步驗(yàn)證“五苓方以散不宜湯的作用機(jī)制是由于水對(duì)低極性成分提取能力有限而導(dǎo)致五苓湯存在多種低極性化合物分子損失”假說(shuō),進(jìn)而闡明五苓方宜散不宜湯的作用機(jī)制,為臨床劑型選擇提供科學(xué)的參考依據(jù)。方法:①以高效液相色譜法考察江西澤瀉、四川澤瀉,福建桂枝、廣西桂枝、廣東桂枝,浙江白術(shù)、湖南白術(shù)、安徽白術(shù),云南豬苓、陜西豬苓、河南豬苓及安徽福茯苓、云南茯苓、湖南茯苓共14個(gè)產(chǎn)地的藥材飲片,分析了 8種指標(biāo)成分在不同產(chǎn)地藥材中的含量;②以MS數(shù)據(jù)分析技術(shù)中Strip工具和QI軟件技術(shù)分析五苓方湯劑和五苓方散劑的入血成分,進(jìn)而對(duì)五苓方湯的入血缺失成分進(jìn)行分析;③采用Caco-2細(xì)胞模型快速篩選工具,研究五苓湯缺失成分23-乙酰澤瀉醇B、桂皮醛、麥角甾醇、茯苓酸和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ五種成分在細(xì)胞水平通過(guò)小腸黏膜的吸收、代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)信息;④以MTT檢測(cè)6種藥物組合及氧糖剝奪時(shí)間對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞本身的損傷作用,以LDH漏出率檢測(cè)各組給藥處理對(duì)氧糖剝奪的細(xì)胞毒作用,采用Western Blot法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4蛋白的表達(dá)情況;⑤采用神經(jīng)功能評(píng)分法檢測(cè)五苓湯缺失成分組合CAE對(duì)MCAO大鼠的腦缺血面積及神經(jīng)功能的改善情況,采用干濕重法測(cè)定腦組織左右腦組織中含水量來(lái)判斷腦水腫的程度,采用Western Blot法檢測(cè)大鼠腦組織中AQP4、Nrf2和HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量情況,來(lái)檢測(cè)五苓湯缺失成分組合對(duì)水通道蛋白的調(diào)節(jié)作用及對(duì)Nrf-2/HO-1信號(hào)通路的作用,利用Luminex技術(shù)檢測(cè)血樣中1L-β、1L-6、TNF-α因子表達(dá)情況來(lái)檢測(cè)對(duì)炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果:①不同產(chǎn)地中藥澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量差異較大,以四川產(chǎn)地含量最高;對(duì)福建、廣西、廣東三個(gè)產(chǎn)地的中藥桂枝干燥品有效成分含量測(cè)定發(fā)現(xiàn),廣東桂枝中桂皮醛和香豆素含量均為最高;白術(shù)的道地產(chǎn)地主要在浙江、安徽、及湖南等地,浙江產(chǎn)地白術(shù)中白術(shù)內(nèi)酯含量明顯高于湖南和安徽產(chǎn)地;湖南茯苓、安徽茯苓、云南茯苓中茯苓酸的含量差異較為明顯,含量最高的是云南茯苓;河南、陜西、云南產(chǎn)地中云南豬苓中麥角甾醇含量最高;②對(duì)UPLC-MS采集數(shù)據(jù)進(jìn)行QI軟件分析,篩選出五苓方湯劑完全缺失成分47種,部分缺失成分6種,并對(duì)6種五苓方湯散劑共有化合物成分進(jìn)行了入血吸收含量-時(shí)間分布研究。與五苓方散劑相比,五苓方湯劑存在嚴(yán)重的化學(xué)成分損失;③經(jīng)過(guò)方法學(xué)考察線性關(guān)系、精密度、方法回收率和穩(wěn)定性均在允許誤差范圍內(nèi);吸收轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn),按難易吸收的判斷標(biāo)準(zhǔn),茯苓酸Papp值均在10-7 cm/s數(shù)量級(jí)屬于難吸收的化合物,桂皮醛Papp值在10-5cm/s數(shù)量級(jí)屬于易吸收化合物,23-乙酰澤瀉醇B位于兩者之間,屬于中等吸收化合物;吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的量效和時(shí)效關(guān)系,不同時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)受試化合物桂皮醛的含量發(fā)現(xiàn),AP-→BL和BL→AP的轉(zhuǎn)運(yùn)率和轉(zhuǎn)運(yùn)速率隨時(shí)間延長(zhǎng)均呈逐漸增加趨勢(shì);④星形膠質(zhì)細(xì)胞氧糖剝奪實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,根據(jù)細(xì)胞抑制率及細(xì)胞活性狀態(tài)篩選出最佳復(fù)氧時(shí)間為6h;最佳給藥濃度為桂皮醛、麥角甾醇和23-乙酰澤瀉醇B的給藥濃度為10 μg/mL,茯苓酸和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ為0.01μg/mL,混合藥物濃度為0.1μg/mL;LDH漏出率隨藥物濃度的增加,呈不斷增高趨勢(shì)。與模型組相比,23-乙酰澤瀉醇B、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、茯苓酸和混合藥組可顯著降低LDH漏出率,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與模型組相比而言,桂皮醛組、23-乙酰澤瀉醇B、麥角甾醇、茯苓酸、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和混合藥物均可顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的AQP4蛋白表達(dá)量,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);⑤與MCAO模型組相比,CAE-L組、CAE-M組和CAE-H組均可顯著改善MCAO大鼠行為異常和神經(jīng)功能障礙,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與Sham組相比,MCAO模型組大鼠缺血側(cè)(即IH側(cè))腦含水量百分比顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與MCAO模型組相比,CAE-H和CAE-M給藥治療均顯著降低MCAO模型組大鼠IH側(cè)腦組織含水量(P0.01/P0.05);與Sham組相比,MCAO模型組大鼠腦組織中AQP4蛋白表達(dá)顯著增加(P0.01),與MCAO模型組比較,CAE低中高劑量組均可顯著下調(diào)MCAO大鼠腦組織中AQP4蛋白的表達(dá),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與Sham組比較,MCAO模型組大鼠血中1L-β、1L-6和TNF-α因子表達(dá)均顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與MCAO模型組相比,灌胃給與CAE-L、CAE-M和CAE-H組的MCAO模型大鼠血中炎癥因子1L-β、1L-6和TNF-α均有不同程度的降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與Sham組相比,MCAO模型組大鼠腦組織內(nèi)Nrf2和HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均有所增加,HO-1蛋白表達(dá)量顯著增加,而Nr2蛋白表達(dá)增加不顯著。與MCAO模型組比較,CAE高、中、低劑量組均可顯著上調(diào)Nrf2和HO-1蛋白的相對(duì)表達(dá)量,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:從藥效物質(zhì)基礎(chǔ)角度而言,藥效活性成分損失必然導(dǎo)致整體藥效的損失,同理五苓湯主要缺失成分對(duì)氧糖剝奪的星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫模型和大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞的腦水腫模型均具有明顯的緩解作用,這些成分的損失必然會(huì)導(dǎo)致五苓湯方的臨床療效,提示“五苓方以散不宜湯的作用機(jī)制是由于水對(duì)低極性成分提取能力有限而導(dǎo)致五苓湯存在多種低極性化合物分子損失”的假說(shuō)得到初步驗(yàn)證。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5;R285
【圖文】：

１．２試劑逡逑色譜級(jí)乙腈（Ｆｉｓｈｅｒ北京康博順達(dá)生物科技有限公司），色譜級(jí)甲醇（Ｆｉｓｈｅｒ逡逑北京康博順達(dá)生物科技有限公司），無(wú)水乙醇（分析純，北京新合聯(lián)創(chuàng)貿(mào)易有限逡逑公司），９５％乙醇（分析純，北京新合聯(lián)創(chuàng)貿(mào)易有限公司），蒸餾水等。逡逑１．３儀器逡逑Ａｇｉｌｅｎｔ邋１２００邋系列高效液相色譜儀（Ａｇｉｌｅｎｔｃｏｍｐａｎｙ），ＮｅｗＣｌａｓｓｉｃＭＳ邋分析逡逑天平（ＭＥＴＴＬＥＲＴＯＬＥＤ⑴，５００克搖擺式中藥粉碎機(jī)（長(zhǎng)沙市常宏制藥機(jī)械逡逑設(shè)備廠），Ｈｅｉ－ＶＡＰＡｄｖａｎｔａｇｅ型Ｈｅｉｄｏｌｐｈ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)海道夫公司），微孔逡逑濾膜，移液槍，容量瓶等。逡逑２方法逡逑２．１樣品溶液的制備逡逑

邐五茶散同方湯劑關(guān)鍵缺失成分入血吸收研究及其抗腦水腫活性評(píng)價(jià)邐逡逑表２－１不同產(chǎn)地澤瀉中２３－乙酰澤瀉醇Ｂ含量逡逑江西澤瀉邐四川澤瀉逡逑化學(xué)成分邐保留時(shí)間邐含量邐保留時(shí)間邐含量逡逑（ｔＢ）邐（％）邐（ｔＢ）邐（％）逡逑２３－乙酰澤瀉醇邋Ｂ邐２１．６３４邐０．１５４邐２１．６８９邐０．３３９逡逑＇２１．４６１逡逑

圖２－２不同樣品中２３－乙酰澤瀉醇Ｂ的ＨＰＬＣ圖逡逑（Ａ對(duì)照品；Ａ，江西澤瀉；四川澤瀉）逡逑表２－２不同產(chǎn)地桂枝中桂皮醛和香＿ａ素含量逡逑福建桂枝邐廣西桂枝邐廣東桂枝逡逑化學(xué)成分逡逑保留時(shí)間邐含量邐保留時(shí)間含量邐保留時(shí)間邐含量逡逑（ｔＢ）邐（％）邐（ｔＢ）邐（％）邐（ｔＢ）邐（％）逡逑桂皮醛邐１４．６６８邐０．７８７邐１４．６７６邐０．７６６邐１４．６３１邐１．３７０逡逑香豆素邐８．１５２邐０．１２７邐８．１５４邐０．１２８邐８．１３６邐０．１５６逡逑

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