【摘要】：目的:通過補(bǔ)陽還五湯對中風(fēng)病氣虛血瘀證腦缺血大鼠AQP4及咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白5(Claudin-5)蛋白表達(dá)的影響,研究中風(fēng)病氣虛血瘀證與AQP4及Occludin、Claudin-5蛋白的關(guān)系,探討中風(fēng)病氣虛血瘀證分子生物學(xué)基礎(chǔ)與病理機(jī)制,為中醫(yī)藥防治缺血性中風(fēng)病及中風(fēng)病證候診斷與研究提供參考。方法:選用 SPF(specificpathogenfreeanimals,SPF)級健康雄性SD(spraguedawley,SD)大鼠180只,將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組,模型組,補(bǔ)陽還五湯組,每組60只。采用控制飼料量造模法結(jié)合大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery obstruction,MCAO)法制備氣虛血瘀證大鼠腦缺血模型,120 min后拔線栓實(shí)施再灌注,造模前三天補(bǔ)陽還五湯組中藥灌胃。在3d和5 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),觀察腦缺血大鼠癥狀的變化,對各組大鼠的神經(jīng)功能及氣虛血瘀證癥狀評分;運(yùn)用干濕重測量法對缺血腦組織的含水量進(jìn)行測定;運(yùn)用伊文思藍(lán)(Evansblue,EB)法檢測血腦屏障通透性;用透射電鏡觀察血腦屏障(blood brain barrier,BBB)超微結(jié)構(gòu)的變化;運(yùn)用Western Blot法檢測缺血腦組織中AQP4的蛋白表達(dá)及BBB緊密連接相關(guān)蛋白Occludin、Claudin-5的表達(dá);運(yùn)用免疫組化的方法檢測缺血腦組織中AQP4蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:(1)各組大鼠在造模前均無神經(jīng)功能癥狀表現(xiàn)。在術(shù)后1d、3d和5d,與假手術(shù)組相比,模型組有明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀,兩組比較有極顯著性差異(P0.001)。與模型組相比,補(bǔ)陽還五湯組神經(jīng)功能改善較顯著,3d時(shí),兩組有顯著差異(P0.01),在 1d和 5d兩組有差異(P0.05)。(2)各組大鼠在造模后氣虛血瘀證癥狀明顯,在3d和5d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),與假手術(shù)組相比,模型組氣虛血瘀證表現(xiàn)更加顯著,兩組之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。與模型組相比,補(bǔ)陽還五湯組氣虛血瘀證癥狀明顯改善,兩組有顯著差異(P0.01)。(3)在3d和5 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),與假手術(shù)組相比,模型組腦組織含水量顯著增高,兩組比較有顯著意義(P0.01);與模型組相比,補(bǔ)陽還五湯組腦組織含水量顯著降低,兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)在3 d和5 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),與假手術(shù)組相比,模型組腦組織EB含量顯著上升,兩組間存在顯著意義(P0.01);補(bǔ)陽還五湯組與模型組相比,補(bǔ)陽還五湯組腦組織EB含量顯著下降,兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)(5)在3d和5 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),假手術(shù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接形態(tài)相對完整,周細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍有少量空泡;模型組血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接形態(tài)損害嚴(yán)重,周細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍空泡變性;與模型組相比,陽還五湯組血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接縫隙變寬,有斷續(xù),形態(tài)相對完整,周細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞周圍有空泡。(6)在3 d和5 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),與假手術(shù)組相比,模型組腦組織緊密連接Occludin、Claudin-5的蛋白表達(dá)水平下降,腦組織中AQP4的蛋白表達(dá)水平上升,兩組間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與模型組相比,補(bǔ)陽還五湯組腦組織緊密連接Occludin、Claudin-5的蛋白表達(dá)水平上升,腦組織中AQP4的蛋白表達(dá)水平下降,兩組之間統(tǒng)計(jì)有差異(P0.05)。(7)腦組織中AQP4蛋白表達(dá)以棕黃色為陽性表達(dá),主要分布在星形膠質(zhì)細(xì)胞,以胞膜為主。在3d和5d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),與假手術(shù)組相比,模型組腦組織中AQP4表達(dá)顯著上升,兩組間存在顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與模型組相比,補(bǔ)陽還五湯組缺血腦組織中AQP4表達(dá)下降,兩組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:造模后大鼠有明顯神經(jīng)功能缺損及氣虛血瘀癥狀,提示中風(fēng)病氣虛血瘀證動(dòng)物模型制備成功。補(bǔ)陽還五湯能夠明顯改善大鼠神經(jīng)功能缺損及氣虛血瘀癥狀,提示補(bǔ)陽還五湯對缺血性中風(fēng)病氣虛血瘀證治療有效。補(bǔ)陽還五湯可能是通過下調(diào)腦組織中AQP4的表達(dá),上調(diào)腦組織中Occludin、Claudin-5的表達(dá)來降低BBB通透性,從而降低腦組織的含水量,以致減輕腦水腫起到腦保護(hù)的作用。腦組織中AQP4、Occludin、Claudin-5蛋白表達(dá)異�？赡苁侵酗L(fēng)病氣虛血瘀證形成的重要機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖１標(biāo)準(zhǔn)品的曲線逡逑屏障超微結(jié)構(gòu)逡逑間點(diǎn)，稱重，腹腔麻醉（方法同上），麻醉后術(shù)剪剪開腹部皮膚，剖開腹腔，用無菌棉簽采血針采取動(dòng)脈血約４邋ｍｌ，止血鉗阻斷腹主，取無頭針自心尖刺入肺動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾固生理鹽水２００邋ｍｌ沖洗至右心耳流出清鹽緩沖液配制的２．５0／0戊二醛溶液２００１１１１固事先預(yù)冷的容器上，取缺血側(cè)頂葉皮質(zhì)１Ｘ１入２．５％戊二醛溶液（電鏡專用）中固定，在４后，再用０．１ｍｏｌ／Ｌ邋（ｐＨ７．４）邋ＰＢＳ漂洗４次，

補(bǔ)陽還五湯對中風(fēng)病氣虛血瘀證腦缺血大鼠ＡＱＰ４及相關(guān)因子影響研究邐逡逑２）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用ＰＢＳ將１０ＵＬＢＳＡ稀釋至１００ＵＬ，按０、２、４、６、８、１２、逡逑邋ＵＬ加入到９６孔板內(nèi)；蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，２邋ｙＬ／？Ｌ；其中３個(gè)復(fù)孔，不足２０邋ＷＬ，均逡逑補(bǔ)足。逡逑３）加工作液：將配制好的工作液加入孔中，２００邋ＵＬ／孔，３７邋°Ｃ孵育３０邋ｍｉｎ．逡逑４）測吸光度：將酶標(biāo)儀調(diào)至５６２邋ｎｍ處測吸光值（Ａ值）。逡逑５）計(jì)算蛋白濃度：根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線（見下圖２），計(jì)算蛋白濃度。逡逑

ｄｕｄｉａｎ－５逡逑ＡＱＰ４逡逑圖１邋ＷＢ測定腦組織中Ｏｃｃｌｕｄｉｎ、Ｃｌａｕｄｉｎ－５、ＡＱＰ４的蛋白表達(dá)情況逡逑ｒ刪壚、逡逑圖２邋３邋ｄ假手術(shù)組血腦屏障超微結(jié)構(gòu)５００００Ｘ邐圖３邋３邋ｄ模型組血腦屏障超微結(jié)構(gòu)５００００Ｘ逡逑

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2772772