【摘要】：本研究以柑橘多甲氧基黃酮提取物中的主要活性成分之一川陳皮素為研究主體,分別在SD大鼠體內(nèi)體外實驗中,探索了川陳皮素的血管舒張效應(yīng),并且深入探討了川陳皮素引起血管舒張效應(yīng)的具體分子機制及相關(guān)舒張、收縮因子的變化,為進一步開發(fā)利用柑橘多甲氧基黃酮提取物及其活性成分川陳皮素作為功能食品或藥品的使用提供理論依據(jù)。SD大鼠體內(nèi)實驗中,首先選取200-250g雄性SD大鼠,腹腔注射15mg/kg/d NG-硝基-左旋精氨酸(L-NNA)28d,制作內(nèi)皮損傷型高血壓大鼠模型,分成6組,即正常對照組(生理鹽水組),造模組(L-NNA模型組),劑量組:L-NNA+川陳皮素低劑量組(1.8mg/kg/d),L-NNA+川陳皮素中劑量組(3.6mg/kg/d),L-NNA+川陳皮素高劑量組(7.2mg/kg/d)和陽性對照組(替米沙坦組80mg/Kg/d),每組設(shè)5只平行大鼠。灌胃共計28d,檢測以下指標變化:(一)分別于14d和28d時通過尾套法測量大鼠尾動脈血壓及心率變化和天平稱量大鼠體重變化;(二)于28d后,采集各實驗組大鼠的動脈血,酶聯(lián)免疫試劑盒測定四種與血管收縮舒張有關(guān)的活性因子(PGI2,ANG2,EDHF和總NO)的含量;(三)于28d后,采集各實驗組大鼠胸主動脈、心臟組織和腎臟組織,經(jīng)HE染色后,觀察組織結(jié)構(gòu)變化。研究結(jié)果表明:(一)SD大鼠L-NNA腹腔注射28d后,與生理鹽水組相比,血壓明顯升高,≥140mm Hg,且血壓上升20mm Hg,表示高血壓大鼠模型造模成功。(二)陽性對照藥替米沙坦組造模后與造模前相比,血壓顯著升高,為178±9.08 mm Hg,具有統(tǒng)計學意義,P0.05,給藥14d后與造模后相比,血壓顯著降低為123±1.56 mmHg,具有統(tǒng)計學意義,P0.05,給藥14d后與給藥28天后相比,血壓降低無統(tǒng)計學意義;川陳皮素低劑量組造模后與造模前相比,血壓顯著升高,為184±29.46 mm Hg,具有統(tǒng)計學意義,P0.05,確認造模成功,給藥14d后與造模后相比,血壓顯著降低,為127±11.59 mm Hg,具有統(tǒng)計學意義,P0.05,給藥28d后與給藥14天后相比,血壓降低無明顯變化,為135±13.23mm Hg,無統(tǒng)計學意義。川陳皮素中劑量組造模后與造模前相比,血壓顯著升高,為196±34.02 mmHg,具有統(tǒng)計學意義,P0.05,確認造模成功,給藥14d后與造模后相比,血壓顯著降低,為124±9.00 mm Hg,具有統(tǒng)計學意義,P0.05,給藥28d后與給藥14d天后相比,血壓降低無明顯變化,為127±9.64 mm Hg,無統(tǒng)計學意義。川陳皮素高劑量組造模后與造模前相比,血壓顯著升高,為175±5.51 mm Hg,具有統(tǒng)計學意義,P0.05,確認造模成功,給藥14d后與造模后相比,血壓顯著降低,為137±7.21 mm Hg,具有統(tǒng)計學意義,P0.05,給藥28d后與給藥14天后相比,血壓降低無明顯變化,為142±10.50 mmHg,無統(tǒng)計學意義。但各劑量組間無統(tǒng)計學差異,且與陽性對照組相比,也無明顯差異,無統(tǒng)計學意義。并且各組間大鼠體重及心率無明顯變化,無統(tǒng)計學意義;此結(jié)果說明在高血壓大鼠模型中,川陳皮素可顯著降低大鼠血壓;(三)酶聯(lián)免疫試劑盒檢測結(jié)果顯示:(1)PGI2含量的變化:川陳皮素低劑量組與造模組比較,川陳皮素對實驗大鼠動脈血中的PGI2含量的變化的影響無統(tǒng)計學意義;川陳皮素中劑量組與低劑量組和造模組,正常組相比,PGI2含量顯著升高,為79.0±6.3 ng/L,具有統(tǒng)計學意義,P0.05;川陳皮素高劑量組與中劑量組相比,川陳皮素對實驗大鼠動脈血中的PGI2含量的影響無統(tǒng)計學意義,而與低劑量組和造模組,正常組相比,PGI2含量顯著升高,為89.8±4.0 ng/L,具有統(tǒng)計學意義,P0.05;(2)ANG2含量的變化:川陳皮素低,中,高三個劑量組在處理前后,實驗大鼠動脈血中的ANG2含量均沒有明顯升高或降低,與正常對照組,造模組及陽性對照組相比,無統(tǒng)計學意義;(3)EDHF含量的變化:川陳皮素低,中,高三個劑量組在處理前后,實驗大鼠動脈血中的EDHF含量均沒有明顯升高或降低,與正常對照組,造模組及陽性對照組相比,無統(tǒng)計學意義;(4)總NO含量的變化:川陳皮素低劑量組與造模組和正常組相比,川陳皮素可顯著增高實驗大鼠動脈血中的總NO含量,為91.3±3.9 ng/L,具有統(tǒng)計學意義,P0.05;川陳皮素中劑量組與造模組和正常組相比,總NO含量顯著升高,為89.0±6.3 ng/L,具有統(tǒng)計學意義,P0.05;川陳皮素高劑量組與造模組和正常組相比,川陳皮素顯著增加實驗大鼠動脈血中的總NO含量,為90.8±4.0 ng/L,具有統(tǒng)計學意義,P0.05,但各劑量組間,總NO含量無明顯差異,無統(tǒng)計學意義,且與陽性對照組相比,也無明顯差異,無統(tǒng)計學意義。此結(jié)果說明在高血壓模型大鼠中,川陳皮素介導的大鼠的抗高血壓效應(yīng)與血漿中的PGI2和總NO含量有關(guān),而與ANG2和EDHF含量無關(guān);(四)HE染色后,顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)各實驗組間,大鼠胸主動脈,心臟組織和腎臟組織的結(jié)構(gòu)均無明顯病理改變。大鼠體外實驗中,選取200-250g雄性SD大鼠,分離腸系膜動脈和肺動脈,(一)給予基礎(chǔ)張力后,10-6M苯腎上腺素(phenylephrine,PE)預收縮,加入10-9-10-5M的川陳皮素,采用血管環(huán)組織浴槽測定血管張力的變化,實驗結(jié)果表明10-5M川陳皮素可明顯誘導大鼠離體腸系膜動脈舒張,舒張率為36.87±3.57%,且呈濃度依賴性,EC50值為16.34±5.61μM,而對離體肺動脈無舒張效應(yīng);(二)在去除內(nèi)皮層的大鼠離體腸系膜動脈血管環(huán)中,10-6M PE預收縮后,加入10-9-10-5M的川陳皮素,觀察血管張力的變化,發(fā)現(xiàn)川陳皮素介導的大鼠離體腸系膜動脈的血管舒張效應(yīng)幾乎消失,說明川陳皮素引起的大鼠離體腸系膜動脈的舒張呈內(nèi)皮依賴性;(三)在內(nèi)皮完整的大鼠離體腸系膜動脈血管環(huán)中,一氧化氮合酶(e NOS)抑制劑ι-NAME(10-4M)孵育30min,10-6M PE預收縮后,加入10-9-10-5M的川陳皮素,發(fā)現(xiàn)川陳皮素介導的大鼠離體腸系膜動脈血管舒張率明顯下降,為21.90±2.06%,說明川陳皮素引起的大鼠離體腸系膜動脈的舒張效應(yīng)與血管內(nèi)皮細胞的e NOS部分相關(guān);(四)在培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中,加入10-5M川陳皮素后,提取細胞蛋白,檢測川陳皮素對總e NOS蛋白的表達和磷酸化e NOS活力的影響,結(jié)果表明與對照組相比,10-5M川陳皮素可明顯增強p-e NOS-1177的活性,但不影響總e NOS蛋白的表達,而e NOS的抑制劑ι-NAME可抑制磷酸化e NOS的活性,說明川陳皮素通過增加p-e NOS-1177的活力來介導血管舒張;(五)在培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中,加入10-5M川陳皮素后,熒光探針檢測了NO產(chǎn)物的含量,結(jié)果表明川陳皮素可明顯增加大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中NO產(chǎn)物的含量,而加入e NOS的抑制劑ι-NAME后,川陳皮素介導NO產(chǎn)物增加的效應(yīng)被抑制,此結(jié)果說明川陳皮素通過激活p-e NOS-1177,增加NO產(chǎn)物含量,介導血管舒張;(六)在內(nèi)皮完整的大鼠離體腸系膜動脈血管環(huán)中,分別孵育PI3K/AKT抑制劑Wortmannin,PKA抑制劑H-89,SIRT1的抑制劑Nicotinamide和RORs的抑制劑SR100130min,PE預收縮后,加入10-9-10-5M的川陳皮素,觀察血管張力的變化,結(jié)果表明川陳皮素介導的大鼠離體腸系膜動脈的血管舒張效應(yīng)無明顯變化,說明川陳皮素舒張大鼠離體腸系膜動脈與PI3K/AKT,PKA,SIRT1和RORs信號通路無關(guān);(七)在內(nèi)皮完整的大鼠離體腸系膜動脈血管環(huán)中,應(yīng)用無鈣液替換有鈣液后,加入10-9-10-5M的川陳皮素,觀察血管張力的變化,結(jié)果表明川陳皮素介導的大鼠離體腸系膜動脈的血管舒張率顯著變小,為12.83±2.22%,具有統(tǒng)計學意義,此結(jié)果說明血管內(nèi)皮細胞中的Ca2+參與了川陳皮素介導的大鼠離體腸系膜動脈的血管舒張效應(yīng);(八)在培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中,加入10-5M川陳皮素后,觀察內(nèi)皮細胞中Ca2+濃度的變化,結(jié)果表明與正常對照組相比,川陳皮素可顯著增加大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中的Ca2+含量,為1.24±0.13,有統(tǒng)計學意義,此結(jié)果說明川陳皮素可顯著提高大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中的Ca2+濃度,高濃度的Ca2+可激活內(nèi)皮細胞的磷酸化e NOS,促進NO產(chǎn)生,發(fā)揮血管舒張效應(yīng);(九)在培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中,孵育Ca2+釋放通道IP3受體的拮抗劑2-APB 30min,加入10-5M川陳皮素后,觀察川陳皮素對內(nèi)皮細胞內(nèi)Ca2+濃度影響的變化,結(jié)果表明在抑制細胞內(nèi)鈣釋放后,川陳皮素介導的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中的Ca2+含量增加的效應(yīng)明顯被抑制,為0.93±0.008,與正常對照組相比,具有統(tǒng)計學意義,P0.01。另外應(yīng)用無鈣液代替有鈣液后,川陳皮素誘導的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中的Ca2+含量也明顯降低,為0.98±0.01,與正常對照組相比,具有統(tǒng)計學意義,P0.01,此結(jié)果說明川陳皮素介導的大鼠主動脈內(nèi)皮細胞中Ca2+含量的增加來源于細胞內(nèi)鈣的釋放和細胞外鈣的內(nèi)流。
【學位授予單位】：東北農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

片劑等[18]。1.2.2 柑橘多甲氧基黃酮提取物我國柑橘類產(chǎn)品資源豐富（圖 1-1），加工及貯藏過程中浪費嚴重，為了合理利用柑橘類產(chǎn)品，可以通過提取、分離、純化得到柑橘多甲氧基黃酮提取物，來提高柑橘類產(chǎn)品的利用率，延長柑橘類產(chǎn)品的使用壽命，拓寬柑橘類產(chǎn)品的應(yīng)用范圍。柑橘多甲氧基黃酮提取物具有多種生理活性，例如抗菌、抗炎，抑制病毒，通過消除氧自由基發(fā)揮抗氧化作用，抑制腫瘤生長發(fā)揮抗癌作用等多種功效[6]，因此近年來深受到研究者的關(guān)注。

常溫下，在水中的溶解度僅為 0.1%，升至 75℃時，溶解度達 10%。微溶于乙醚，溶于石油醚，苯，氯仿等。通常避光保存于陰涼干燥處。川陳皮素來源廣泛，可從蕓香柑橘屬的皮，莖，葉，枝等的提取物中通過醇提，萃取，層析及結(jié)晶方法獲得，為柑橘甲氧基黃酮化合物中的主要成分之一，另外也可以通過化學合成的方式獲得。研究表明，陳皮素具有多種功效，可用于食品加香劑和食品保鮮劑，具有抗炎，抗腫瘤，抗過敏，高記憶力，抗動脈粥樣硬化，改善血管活性等[15]多種生物活性。

圖 1-3 川陳皮素全合成路線圖Fig.1-3 The whole synthetic route of Nobiletin川陳皮素的檢測目前一般通過 HPLC 及 GC-MS 等方法來檢測，但由于川陳皮素來源廣泛，其中所含干擾因素較多，因此對于檢測方法及條件的優(yōu)化，仍在進一步探索中。1.2.3.3 川陳皮素的代謝產(chǎn)物采用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-MS/MS）技術(shù)分析川陳皮素在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，經(jīng)綜合分析后，共得到 7 個代謝產(chǎn)物。其中 I 相代謝產(chǎn)物為 3 個，由川陳皮素分別脫去一個和兩個甲基所得。II 代謝產(chǎn)物為 4 個，由 I 相代謝產(chǎn)物經(jīng)硫酸化和葡糖醛酸化生成（圖 1-5）[15]。川陳皮素的代謝產(chǎn)物大多也具有生物活性。如 Wu X 等[42]研究發(fā)現(xiàn)在 LPS 處理的RAW264.7 細胞中，4’- demethylnobiletin（4DN）不僅可抑制 LPS 誘導的 NO 產(chǎn)生，還可明顯減少前炎癥因子 PGE2，IL-1β 和 IL-6 的表達，也可抑制 NF-κB 和 AP-1 的核轉(zhuǎn)位。而且 4DN 還可激活轉(zhuǎn)錄因子 Nrf2 及其下游基因 HO-1 和 NQO1，有助于由炎癥引起的疾病的治療。Lai CS 等[43]研究了川陳皮素的代謝產(chǎn)物 3’, 4’-didemethylnobiletin（DDMN）的抗炎和抗腫瘤活性，結(jié)果表明 DDMN 在小鼠皮膚組織中，可通過下調(diào) iNOS，COX-2 和 ODC基因的表達，發(fā)揮有效的抗炎和抗腫瘤效應(yīng)，揭示或可被抑制與炎癥相關(guān)的腫瘤生長。Tung[44]

【參考文獻】

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2 羅世坤;王家歡;徐蘭英;龍濤;李士明;;陳皮中川陳皮素的提取分離及改性[J];食品科學;2014年24期

3 楊金果;李運倫;周洪雷;;鉤藤和萊菔子生物堿抗高血壓血管內(nèi)皮細胞損傷效應(yīng)[J];中成藥;2013年05期

4 宋家玲;楊永建;李強;戚歡陽;;多甲氧基黃酮類化合物研究進展[J];中國實驗方劑學雜志;2012年17期

5 金生源;;對祖國醫(yī)學“藥食同源”的現(xiàn)代理解與展望[J];浙江中醫(yī)藥大學學報;2011年01期

6 韓金旦;王奎武;沈蓮清;;枳實中多甲氧基黃酮類化合物的研究[J];時珍國醫(yī)國藥;2010年10期

7 鄭國棟;周芳;蔣林;楊得坡;楊雪;林樂維;;高速逆流色譜分離制備廣陳皮中多甲氧基黃酮類成分的研究[J];中草藥;2010年01期

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本文編號：2771679