【摘要】：研究目標(biāo):觀察中藥單體華蟾素(Cinobufagin,簡稱為CBG)抗結(jié)腸癌(Colon cancer)細(xì)胞作用,明確其作用機(jī)制。研究方法和內(nèi)容:四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法、細(xì)胞集落試驗(Clonogenicity assay)、Brd U酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測華蟾素處理不同時間后,對結(jié)腸癌細(xì)胞存活及細(xì)胞增殖的影響;TUNEL細(xì)胞核染色方法、Annexin V-碘化丙啶(PI)流式細(xì)胞儀(FACS)法,及Histone-DNA ELISA法、檢測華蟾素對結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的作用;碘化吡啶(PI)流式細(xì)胞儀法觀察CBG干預(yù)后結(jié)腸癌細(xì)胞周期的變化;運用免疫印跡(Western blot)方法檢測CBG干預(yù)后結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER應(yīng)激)、m TOR復(fù)合物1(m TORC1)等信號通路水平的活化水平;導(dǎo)入持續(xù)活化的S6K1質(zhì)粒(CA-S6K1),觀察藥物干預(yù)后CBG體外抗結(jié)腸癌細(xì)胞活性的變化;建立裸鼠荷瘤模型,觀察CBG在體抗結(jié)腸癌細(xì)胞的活性。研究結(jié)果:CBG顯著抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞及原代人結(jié)腸癌細(xì)胞的存活和增殖。CBG對正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞無顯著毒性作用。CBG誘導(dǎo)結(jié)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡,并導(dǎo)致結(jié)腸癌細(xì)胞周期G2-M期阻滯。CBG激活結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)ER應(yīng)激通路。使用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激抑制劑(Salubrina),caspase-12抑制劑(z ATADfmk)或CHOP沉默(通過目的性sh RNAs)的方法能夠明顯的減弱CBG誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的死亡和凋亡。CBG抑制結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)m TORC1的活化,而導(dǎo)入持續(xù)活化的S6K1質(zhì)粒抑制CBG誘導(dǎo)的抗增殖作用。CBG腹腔注射抑制裸鼠中HCT-116皮下移植瘤生長。分析腫瘤組織發(fā)現(xiàn),CBG干預(yù)的瘤組織中存在CHOP上調(diào)和m TORC1失活。研究結(jié)論:CBG具有顯著的體外及在體抗結(jié)腸癌細(xì)胞作用,其作用機(jī)制可能和其激活ER應(yīng)激和抑制m TORC1有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

即抑制 50％HCT-116 細(xì)胞存活的濃度小于 50 ng/mL（圖1a）。而最低濃度的 CBG（1 ng/mL）未能顯著影響 HCT-116 細(xì)胞的存活（圖 1a）。與此同時，CBG 還時間依賴性抑制 HCT-116 細(xì)胞存活（圖 1a），在 CBG（50-250ng/mL）干預(yù)后 24 小時后，就注意到顯著的細(xì)胞活力降低，并且在 48 和 72h 時更顯著（圖 1a）。我們還檢測了 CBG（100 ng/mL，48 小時）對其它人結(jié)腸癌細(xì)胞株的影響。HT-29 也是一種常見的結(jié)腸癌細(xì)胞株。研究證實，添加 100ng/mL 的 CBG 同樣對 HT-29 細(xì)胞具有細(xì)胞毒性（圖 1b）。用指定濃度（1-250 ng/mL）的華蟾素（Cinobufagin，簡稱為 CBG）干預(yù)人結(jié)腸癌（Colon cancer）HCT-116（圖 1a）和 HT-29（圖 1b）細(xì)胞株，進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞指定時間；通過MTT方法檢測細(xì)胞存活率�！癈trl”代表未經(jīng)CBG干預(yù)的對照組。* p <0.05vs. “Ctrl”組。該圖中的實驗重復(fù)五次

第一部分 中藥單體華蟾素抗人結(jié)腸癌細(xì)胞作用和機(jī)制研究用指定濃度（1-250 ng/mL）的華蟾素（Cinobufagin，簡稱為 CBG）干預(yù)人結(jié)腸癌（Colon cancer）HCT-116（圖 2a）和 HT-29（圖 2b）細(xì)胞株，每 2 天更新 CBG 干預(yù)共 5 次，后觀察并計數(shù)克隆數(shù)目�！癈trl”代表未經(jīng) CBG 干預(yù)的對照組。* p <0.05 vs.“Ctrl”組。該圖中的實驗重復(fù)五次，得到相似的結(jié)果。每次重復(fù) n = 5。

圖 3 華蟾素抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖4 華蟾素抑制原代培養(yǎng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞存活我們還檢測了 CBG 對其他人結(jié)腸癌細(xì)胞的影響。本研究中，我們原代培養(yǎng)了 2株人結(jié)腸癌細(xì)胞，其分別命名為“Pri Colon-1 / -2”。 MTT 結(jié)果證實，用 CBG（100ng/mL，48 小時）干預(yù)顯著降低了原代培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞的存活（圖 4a）。同時，相同的 CBG 干預(yù)也對 PANC-1 胰腺癌細(xì)胞 [19-23]具有細(xì)胞毒性（圖 4a）[21]。值得注意的是，CBG（100 ng/mL，48 小時）干預(yù)對人原代結(jié)腸上皮細(xì)胞（“Colon Epi”）和HPDE6c7 胰腺上皮細(xì)胞（“Pan Epi”）[23, 24]無顯著的細(xì)胞毒性作用（圖 4b）。CBG（100 ng/mL，48 小時）干預(yù)后，上述上皮細(xì)胞的 MTT OD 值無顯著變化（圖 4b）。這些結(jié)果表明 CBG 對癌細(xì)胞具有選擇性的細(xì)胞毒性。100 ng/mL 的華蟾素（Cinobufagin，簡稱 CBG）干預(yù)上述癌細(xì)胞（圖 4a）或非癌性上皮細(xì)胞（圖 4b）進(jìn)一步培養(yǎng)細(xì)胞 48 小時；通過 MTT 方法檢測細(xì)胞存活率�！癈trl”代表未經(jīng) CBG 干預(yù)的對照組。* p <0.05 vs. “Ctrl”組。該圖中的實驗重復(fù)

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本文編號：2771598