【摘要】：目的:用蛋白酶體抑制劑(Proteasome inhibitor,PSI)誘導(dǎo)PC12細胞,建立體外大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(pheochromocy-toma cells,PC12)帕金森病模型,以細胞增殖周期、凋亡、SOD活性和MDA水平以及泛素蛋白酶體途徑為研究切入點,探討牽正散合大補陰丸對細胞增殖周期、凋亡、SOD活性和MDA水平以及泛素蛋白酶體途徑中相關(guān)因子TBP1-19、PA28α在蛋白表達水平的影響,從細胞和分子水平上明確牽正散合大補陰丸對PC12細胞的影響,從而確定牽正散合大補陰丸對帕金森(顫證)的作用。方法:利用MTT法檢測牽正散水煎劑及大補陰丸水煎劑對PC12細胞的細胞毒性作用;采用DAPI染色及伊紅染色相結(jié)合的方法,利用倒置熒光顯微鏡觀察確定PSI誘導(dǎo)PC12細胞形成的帕金森病細胞模型的合適劑量;利用HE染色觀察PSI誘導(dǎo)PC12細胞的體外帕金森病模型的嗜酸性小體;利用MTT法確定牽正散水煎劑及大補陰丸水煎劑對PSI誘導(dǎo)PC12細胞的體外帕金森病模型增殖的影響;采用流式細胞術(shù)檢測牽正散合大補陰丸水煎劑干預(yù)48h時PSI誘導(dǎo)的PC12細胞模型周期變化情況以及細胞死亡情況;Annexin V/FITC流式細胞分析法檢測細胞凋亡率;采用SOD、MDA檢測法測定牽正散合大補陰丸水煎劑干預(yù)48h對PSI誘導(dǎo)的PC12細胞模型的細胞內(nèi)SOD值與MDA值的影響;利用Western Blot技術(shù)測定牽正散合大補陰丸水煎劑在有無PSI誘導(dǎo)時時對細胞內(nèi)相關(guān)因子TBP1-19、PA28α蛋白表達的影響。結(jié)果:MTT結(jié)果顯示,不同濃度的牽正散、大補陰丸對細胞增殖有不同的影響:作用細胞48h時,牽正散水煎劑從6 mg/ml濃度開始顯示出對細胞增殖的抑制作用,12及24mg/ml濃度的抑制率分別為61%及91%;大補陰丸水煎劑從0.125mg/ml濃度開始顯示出對細胞增殖的抑制作用,0.25、0.5、1及2mg/ml濃度的抑制率分別為14%、9.8%、0.64%及26.46%;不同濃度的牽正散水煎劑及大補陰丸水煎劑均可改善PSI對PC12細胞增殖的抑制作用。用SPSS Statistics 20軟件計算出藥物相應(yīng)IC0、IC25及IC50,牽正散水煎劑對大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12細胞作用48h的ICO為0.2 mg/ml、IC25為12.292 mg/ml、IC50為22.652 mg/ml,大補陰丸水煎劑對大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12細胞作用48h的IC0為0.814mg/ml、IC25為4.485mg/ml、IC50為9.004mg/ml;體外MTT法實驗結(jié)果顯示,12.292mg/ml(IC25)濃度的牽正散水煎劑與4.485mg/ml(IC25)濃度的大補陰丸水煎劑表現(xiàn)出的緩解PSI誘導(dǎo)的PC12細胞模型損傷較為顯著。DAPI及伊紅染色顯示PSI在濃度為6μmol/L時,PC12細胞的形態(tài)改變及胞漿中嗜酸性小體表現(xiàn)最為典型;HE染色后,倒置顯微鏡下觀察結(jié)果顯示PSI作用下PC12形態(tài)及數(shù)量均發(fā)生改變。流式細胞術(shù)周期結(jié)果顯示,PSI誘導(dǎo)大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞會影響細胞周期,但牽正散合大補陰丸未見明顯改善細胞周期。Annexin V/FITC流式細胞分析法凋亡結(jié)果顯示,PSI組細胞凋亡率升高,加藥組不同程度降低凋亡率。SOD及MDA含量檢測結(jié)果顯示,PSI組與空白對照組相比大鼠嗜鉻細胞瘤細胞PC12的SOD活力值下降,脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量升高;加藥處理后,各劑量組牽正散水煎劑與大補陰丸水煎劑與PSI組相比SOD活力升高、MDA含量下降。Western Blot結(jié)果顯示,PSI誘導(dǎo)PC12細胞后,可增加TBP1-19、PA28α的蛋白表達量。加藥處理后,與PSI組相比,各劑量組牽正散水煎劑可降低TBP1-19、PA28α蛋白表達量;各劑量組大補陰丸水煎劑能降低TBP1-19、PA28α蛋白的表達量。結(jié)論:PSI誘導(dǎo)的PC12體外帕金森模型具有科學(xué)意義;牽正散水煎劑、大補陰丸水煎劑及合方均可緩解PSI對PC12體外帕金森模型的抑制作用,可提高PSI誘導(dǎo)的PC12細胞存活率;其機制為調(diào)控PSI誘導(dǎo)的PC12細胞凋亡及細胞內(nèi)SOD、MDA含量,此外,通過調(diào)節(jié)泛素蛋白酶體途徑中相關(guān)因子TBP1-19、PA28α蛋白水平的表達來影響機體的代謝,從而發(fā)揮緩解帕金森(顫證)作用。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5;R-332
【圖文】：

誘導(dǎo)ＰＣ１２細胞凋亡具有神經(jīng)保護作用。越來越多的證據(jù)表明，ＵＰＰ的紊亂可能導(dǎo)致許多疾逡逑病，如惡性腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和可能的系統(tǒng)性自身免疫。逡逑上述信號通路對帕金森病作用過程總結(jié)如下圖１所示。逡逑Ｐ側(cè)ＡＰＫ辟sE一？邐元保逡逑Ｗｎｔ／ｐ－？ｔｅｎ，ｎ（ｇ＾邋￣￣逡逑Ｊ邐減緩帕金森�。掊义希慑暹婂暹婂暹婂澹�、（邋ＩＫＥ）進程）逡逑Ｍｒ＞ｒ，邋Ｍ邋＾邐ｈ激；ＳＥｒｂ邋Ｂ家族的栜邐．增強通路活性．保護逡逑ＮＲＧｌ－ｔｒＤＢ４ｆＳ＾邋邐？促迎媂胞內(nèi)傳導(dǎo)￣？多巴胺神經(jīng)元逡逑｜減短內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，降邐｜卿線粒體凋亡途徑逡逑泛Ｍ白z1體途徑邋邐？低通臼酹體的降解．一？的活化，抑制x紀觶哄義希擼咤邋五五五澹蝳蔽誨危哂猩窬被ё饔緬危掊義賢跡保保慘┪锿ü藕磐范耘兩鶘∽饔霉體義獻凵纖觶疃嘀幸揭┩ü藕磐范耘兩鶘〉鬧瘟貧加幸歡菩�，且其謱戵部钒櫫x霞旱玫攪俅彩匝榱菩еС幀Ｅ兩鶘〉姆⒉』粕形賜耆徊鰨古兩鶘┪鎦淶南噱義匣ブ饕頻奶剿骰共懷溝�。但中医药灾u瘟疲校姆矯婢哂瀉艽笄繃�，临床实褭┬，中药辅辶x現(xiàn)瘟票鵲ゴ課饕┲瘟貧裕校幕頰哂懈玫牧菩

本文編號：2767267