【摘要】：肺纖維化(PF)作為多種原因引起的肺泡正常結(jié)構(gòu)被損傷最終導致肺間質(zhì)性纖維化病變的纖維異常增生性疾病~([1、2])。目前肺纖維化發(fā)病機制尚未明確,又無特殊有效的治療方法,導致肺纖維化致殘率、死亡率頗高,嚴重威脅人類健康。肺纖維化作為現(xiàn)代醫(yī)學疑難雜癥,明確其發(fā)病機制和防治策略對人類健康具有積極意義。諸多相關研究表明在肺纖維化形成過程中,自噬并未被激活,自噬不足、缺陷,PTEN、ULK1含量極低,肺纖維化形成加快。能否通過提高PTEN、ULK1含量,激活或誘導自噬來延遲肺纖維化?肺纖維化作為現(xiàn)代醫(yī)學疑難雜癥,我們補陽還五湯課題組在以往采用益氣、活血、通絡研究肺纖維化過程中,TGF-β1可能通過Smad和PI3K/Akt/m TOR信號通路抑制自噬。我們在以往的研究中發(fā)現(xiàn)補陽還五湯能夠在保外啟動多條與肺纖維化有關的信號通路,例如TGF-β1/Smad、MAPKs、NF-kB等相關信號通路,而這些信號通路和細胞自噬存在相關聯(lián)系~([1-4])�；诖�,我們根據(jù)以往的研究基礎,我們選擇與細胞自噬密切相關的mTOR信號通路,通過該信號通路來研究細胞自噬,探尋細胞自噬和肺纖維化之間的關系,揭示補陽還五湯防治肺纖維化的機制。目的:本研究采用C57小鼠動物體內(nèi)實驗,結(jié)合人胚肺成纖維細胞(HFL1)、人胚肺細胞(MRC5),通過體內(nèi)、體外細胞實驗,來研究驗證m TOR信號通路和肺纖維化的關系,探尋細胞自噬和肺纖維化之間的關系,揭示補陽還五湯防治肺纖維化的機制。方法:1、將144只SPF級健康雄性C57BL/6小鼠隨機分為6組,NS組、BLM組、強的松組、補陽還五湯高、中、低劑量組,第7天、第14天和第28天隨機抽取8只股動脈放血處死取肺組織作HE、Masson病理切片和免疫組化檢測mTOR、。2、將HFL1、MRC5細胞分為六組:空白組、TGF-β1刺激組、20%空白血清組、補陽還五湯含藥血清5%、10%、20%三個組,采用5ng/ml的TGF-β1刺激HFL1、MRC5細胞后,使用5%、10%、20%的補陽還五湯含藥血清進行干預,24h后提取細胞培養(yǎng)液上清。通過ELISA法檢測補陽還五湯含藥血清在體外對細胞培養(yǎng)上清中α-SMA、p-S6等蛋白表達的影響。將HFL1、MRC5細胞分為六組:空白組、TGF-β1刺激組、20%空白血清組、補陽還五湯含藥血清5%、10%、20%三個組,采用5ng/ml的TGF-β1刺激HFL1、MRC5細胞后,使用5%、10%、20%的補陽還五湯含藥血清進行干預,分別在0、6、12、24、48、72h時提取細胞總蛋白。通過Western blot法檢測補陽還五湯含藥血清在在體外不同時間內(nèi)對細胞總蛋白中PTEN、ULK1等蛋白表達的影響。結(jié)果:1、一般情況:空白組小鼠,精神抖擻,機警靈敏,體重增加,毛發(fā)光亮,飲食、排便正常。模型組小鼠,7天后精神不振,反應遲鈍,體重下降。14天后精神萎靡,反應遲緩,體重下降明顯,毛發(fā)失澤,飲食量少,小便較多,飼養(yǎng)籠內(nèi)木屑被小便溺濕。28天精神發(fā)呆,站立不穩(wěn)或行動困難,脫毛亂雜無光,體格瘦弱,飲食差,小便多,飼養(yǎng)籠內(nèi)多處木屑被小便溺濕。補陽還五湯和強的松組小鼠,精神較好,反應敏捷,體重逐步增加,毛發(fā)光澤,飲食、排便基本正常。但比空白組稍差,比模型組好。2、病理形態(tài)學:小鼠肺組織HE染色顯示,NS組7天肺結(jié)構(gòu)基本完整,肺泡間隔未增厚,無明顯炎癥浸潤,14天、28天基本正常,BLM組7天肺結(jié)改變,間隔水腫,肺泡壁增厚,充血、炎癥浸潤。第14天灶性區(qū)充血、水腫,間隔增寬,伴炎癥浸潤,肺泡壁纖維增生,肺泡萎縮。第28天肺泡炎減輕,肺泡破壞,間隔明顯增寬、斷裂,大量成纖維細胞,膠原沉積,纖維瘢痕出現(xiàn)。補陽還五湯各劑量組不同程度改善。強的松組與補陽還五湯各劑量組類似。肺泡受破壞,泡壁增厚,輕度水腫。小鼠肺組織Masson染色顯示,NS組7天肺泡區(qū)未見明顯淺藍色膠原纖維,14天、28天未見擴大。BLM組7天間隔增寬,泡壁、間隔可見藍色膠原纖維,14天血管壁、肺泡間隔可見藍色膠原纖維,28天細支氣管、纖維灶區(qū)大量藍色膠原纖維,彌漫性分布。強的松組與補陽還五湯各劑量組7天間隔增寬,可見藍色膠原纖維,14天藍色擴大,加深。28天未見明顯擴大、加深。比BLM組顏色淺、面積小。3、α-SMA、p-S6、ULK1、mTOR蛋白表達:與NS組比較,BLM組在7、14、28天的α-SMA含量均升高,而且隨著時間推移,逐步升高,在28d達到峰值,*P0.05。與BLM組相比,強的松組和補陽還五湯組在7、14、28天的α-SMA含量均降低,~#P0.05。與強的松組相比,補陽還五湯高、中、低組在14、28天的α-SMA含量均降低,~△P0.05。與NS組比較,BLM組在7、14、28d的p-S6含量均升高,而且隨著時間推移,逐步升高,在28d達到峰值,~*P0.05。與BLM組相比,強的松組在14、28d的p-S6含量降低,補陽還五湯組在14、28d的p-S6含量均降低,~#P0.01。與強的松組相比,補陽還五湯低組在7d、14d的p-S6含量降低,補陽還五湯中組在7d的含量均降低,補陽還五湯高組在28d的含量降低,~△P0.05。與NS組比較,BLM組在7、14、28d的ULK1含量均升高,~*P0.01。與BLM組相比,強的松組在7、14、28d的ULK1含量均升高,~#P0.05;補陽還五湯低、中組在28d的ULK1含量均升高,補陽還五湯高組在14、28d的ULK1含量均升高,~#P0.05。與強的松組相比,補陽還五湯中、低組在28d的ULK1含量升高,補陽還五湯高組在14d、28d的ULK1含量升高,~△P0.05。與NS組比較,BLM組mTOR含量均上升,~*P0.01。與BLM組相比,強的松組和補陽還五湯組在7、14、28d的mTOR含量均下降,~#P0.05。與強的松組相比,補陽還五湯高組在7、14d、28d的mTOR含量下降,~△P0.05。4、ELISA檢測結(jié)果顯示,采用不同濃度補陽還五湯含藥血清干預HFL1、MRC5細胞0.5h后采用5ng/ml的TGF-β1刺激HFL1、MRC5細胞后,細胞內(nèi)α-SMA、p-S6蛋白表達明顯X椉

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