發(fā)布時(shí)間：2020-07-23 10:38

【摘要】：肺纖維化(PF)作為多種原因引起的肺泡正常結(jié)構(gòu)被損傷最終導(dǎo)致肺間質(zhì)性纖維化病變的纖維異常增生性疾病~([1、2])。目前肺纖維化發(fā)病機(jī)制尚未明確,又無特殊有效的治療方法,導(dǎo)致肺纖維化致殘率、死亡率頗高,嚴(yán)重威脅人類健康。肺纖維化作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疑難雜癥,明確其發(fā)病機(jī)制和防治策略對(duì)人類健康具有積極意義。諸多相關(guān)研究表明在肺纖維化形成過程中,自噬并未被激活,自噬不足、缺陷,PTEN、ULK1含量極低,肺纖維化形成加快。能否通過提高PTEN、ULK1含量,激活或誘導(dǎo)自噬來延遲肺纖維化?肺纖維化作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)疑難雜癥,我們補(bǔ)陽還五湯課題組在以往采用益氣、活血、通絡(luò)研究肺纖維化過程中,TGF-β1可能通過Smad和PI3K/Akt/m TOR信號(hào)通路抑制自噬。我們?cè)谝酝难芯恐邪l(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯能夠在保外啟動(dòng)多條與肺纖維化有關(guān)的信號(hào)通路,例如TGF-β1/Smad、MAPKs、NF-kB等相關(guān)信號(hào)通路,而這些信號(hào)通路和細(xì)胞自噬存在相關(guān)聯(lián)系~([1-4])�；诖�,我們根據(jù)以往的研究基礎(chǔ),我們選擇與細(xì)胞自噬密切相關(guān)的mTOR信號(hào)通路,通過該信號(hào)通路來研究細(xì)胞自噬,探尋細(xì)胞自噬和肺纖維化之間的關(guān)系,揭示補(bǔ)陽還五湯防治肺纖維化的機(jī)制。目的:本研究采用C57小鼠動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),結(jié)合人胚肺成纖維細(xì)胞(HFL1)、人胚肺細(xì)胞(MRC5),通過體內(nèi)、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),來研究驗(yàn)證m TOR信號(hào)通路和肺纖維化的關(guān)系,探尋細(xì)胞自噬和肺纖維化之間的關(guān)系,揭示補(bǔ)陽還五湯防治肺纖維化的機(jī)制。方法:1、將144只SPF級(jí)健康雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組,NS組、BLM組、強(qiáng)的松組、補(bǔ)陽還五湯高、中、低劑量組,第7天、第14天和第28天隨機(jī)抽取8只股動(dòng)脈放血處死取肺組織作HE、Masson病理切片和免疫組化檢測(cè)mTOR、。2、將HFL1、MRC5細(xì)胞分為六組:空白組、TGF-β1刺激組、20%空白血清組、補(bǔ)陽還五湯含藥血清5%、10%、20%三個(gè)組,采用5ng/ml的TGF-β1刺激HFL1、MRC5細(xì)胞后,使用5%、10%、20%的補(bǔ)陽還五湯含藥血清進(jìn)行干預(yù),24h后提取細(xì)胞培養(yǎng)液上清。通過ELISA法檢測(cè)補(bǔ)陽還五湯含藥血清在體外對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清中α-SMA、p-S6等蛋白表達(dá)的影響。將HFL1、MRC5細(xì)胞分為六組:空白組、TGF-β1刺激組、20%空白血清組、補(bǔ)陽還五湯含藥血清5%、10%、20%三個(gè)組,采用5ng/ml的TGF-β1刺激HFL1、MRC5細(xì)胞后,使用5%、10%、20%的補(bǔ)陽還五湯含藥血清進(jìn)行干預(yù),分別在0、6、12、24、48、72h時(shí)提取細(xì)胞總蛋白。通過Western blot法檢測(cè)補(bǔ)陽還五湯含藥血清在在體外不同時(shí)間內(nèi)對(duì)細(xì)胞總蛋白中PTEN、ULK1等蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1、一般情況:空白組小鼠,精神抖擻,機(jī)警靈敏,體重增加,毛發(fā)光亮,飲食、排便正常。模型組小鼠,7天后精神不振,反應(yīng)遲鈍,體重下降。14天后精神萎靡,反應(yīng)遲緩,體重下降明顯,毛發(fā)失澤,飲食量少,小便較多,飼養(yǎng)籠內(nèi)木屑被小便溺濕。28天精神發(fā)呆,站立不穩(wěn)或行動(dòng)困難,脫毛亂雜無光,體格瘦弱,飲食差,小便多,飼養(yǎng)籠內(nèi)多處木屑被小便溺濕。補(bǔ)陽還五湯和強(qiáng)的松組小鼠,精神較好,反應(yīng)敏捷,體重逐步增加,毛發(fā)光澤,飲食、排便基本正常。但比空白組稍差,比模型組好。2、病理形態(tài)學(xué):小鼠肺組織HE染色顯示,NS組7天肺結(jié)構(gòu)基本完整,肺泡間隔未增厚,無明顯炎癥浸潤(rùn),14天、28天基本正常,BLM組7天肺結(jié)改變,間隔水腫,肺泡壁增厚,充血、炎癥浸潤(rùn)。第14天灶性區(qū)充血、水腫,間隔增寬,伴炎癥浸潤(rùn),肺泡壁纖維增生,肺泡萎縮。第28天肺泡炎減輕,肺泡破壞,間隔明顯增寬、斷裂,大量成纖維細(xì)胞,膠原沉積,纖維瘢痕出現(xiàn)。補(bǔ)陽還五湯各劑量組不同程度改善。強(qiáng)的松組與補(bǔ)陽還五湯各劑量組類似。肺泡受破壞,泡壁增厚,輕度水腫。小鼠肺組織Masson染色顯示,NS組7天肺泡區(qū)未見明顯淺藍(lán)色膠原纖維,14天、28天未見擴(kuò)大。BLM組7天間隔增寬,泡壁、間隔可見藍(lán)色膠原纖維,14天血管壁、肺泡間隔可見藍(lán)色膠原纖維,28天細(xì)支氣管、纖維灶區(qū)大量藍(lán)色膠原纖維,彌漫性分布。強(qiáng)的松組與補(bǔ)陽還五湯各劑量組7天間隔增寬,可見藍(lán)色膠原纖維,14天藍(lán)色擴(kuò)大,加深。28天未見明顯擴(kuò)大、加深。比BLM組顏色淺、面積小。3、α-SMA、p-S6、ULK1、mTOR蛋白表達(dá):與NS組比較,BLM組在7、14、28天的α-SMA含量均升高,而且隨著時(shí)間推移,逐步升高,在28d達(dá)到峰值,*P0.05。與BLM組相比,強(qiáng)的松組和補(bǔ)陽還五湯組在7、14、28天的α-SMA含量均降低,~#P0.05。與強(qiáng)的松組相比,補(bǔ)陽還五湯高、中、低組在14、28天的α-SMA含量均降低,~△P0.05。與NS組比較,BLM組在7、14、28d的p-S6含量均升高,而且隨著時(shí)間推移,逐步升高,在28d達(dá)到峰值,~*P0.05。與BLM組相比,強(qiáng)的松組在14、28d的p-S6含量降低,補(bǔ)陽還五湯組在14、28d的p-S6含量均降低,~#P0.01。與強(qiáng)的松組相比,補(bǔ)陽還五湯低組在7d、14d的p-S6含量降低,補(bǔ)陽還五湯中組在7d的含量均降低,補(bǔ)陽還五湯高組在28d的含量降低,~△P0.05。與NS組比較,BLM組在7、14、28d的ULK1含量均升高,~*P0.01。與BLM組相比,強(qiáng)的松組在7、14、28d的ULK1含量均升高,~#P0.05;補(bǔ)陽還五湯低、中組在28d的ULK1含量均升高,補(bǔ)陽還五湯高組在14、28d的ULK1含量均升高,~#P0.05。與強(qiáng)的松組相比,補(bǔ)陽還五湯中、低組在28d的ULK1含量升高,補(bǔ)陽還五湯高組在14d、28d的ULK1含量升高,~△P0.05。與NS組比較,BLM組mTOR含量均上升,~*P0.01。與BLM組相比,強(qiáng)的松組和補(bǔ)陽還五湯組在7、14、28d的mTOR含量均下降,~#P0.05。與強(qiáng)的松組相比,補(bǔ)陽還五湯高組在7、14d、28d的mTOR含量下降,~△P0.05。4、ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,采用不同濃度補(bǔ)陽還五湯含藥血清干預(yù)HFL1、MRC5細(xì)胞0.5h后采用5ng/ml的TGF-β1刺激HFL1、MRC5細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)α-SMA、p-S6蛋白表達(dá)明顯X椉

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