【摘要】：目的前期通過親和“垂釣”、凝膠電泳和蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定,發(fā)現(xiàn)肌肉型肌酸激酶(CK-MM)是人參皂苷在骨骼肌組織內(nèi)的作用靶點(diǎn)。課題組以20(S)-原人參二醇[20(S)-PPD]為代表,采用生物膜層干涉技術(shù)(BLI)和等溫滴定量熱技術(shù)(ITC)確證了20(S)-PPD與CK-MM之間的直接相互作用。此外,體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20(S)-PPD可以通過別構(gòu)調(diào)節(jié)的方式激活CK-MM的活性,增加骨骼肌組織中磷酸肌酸(PCr)的含量,增強(qiáng)骨骼肌CK/PCr系統(tǒng)的功能,從而可有效延緩運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練誘導(dǎo)的乳酸堆積,發(fā)揮抗疲勞的效應(yīng)。然而,20(S)-PPD激活CK-MM活性的程度并不理想,體外對(duì)鼠源性和人源性CK-MM活性的最大提高幅度約10%。眾所周知,20(S)-PPD屬于達(dá)瑪烷類天然產(chǎn)物。本學(xué)位論文試圖探討達(dá)瑪烷類天然產(chǎn)物激活CK-MM的構(gòu)效關(guān)系,為從天然產(chǎn)物中或采用結(jié)構(gòu)修飾的方式尋找更好的CK-MM激活劑提供前期支撐。方法實(shí)驗(yàn)1:酸棗仁苷元(Jujubogenin)與24-羧基-原人參二醇(24-COOH-PPD)的制備先用大孔吸附樹脂D101聯(lián)合陰陽離子交換樹脂D201及D113,制備高純度酸棗仁總皂苷,再根據(jù)報(bào)道的文獻(xiàn),用氧化切割法制備粗Juj ubogenin,最后用硅膠柱層析、甲醇重結(jié)晶制備高純度Juj ubogenin,用薄層色譜和HPLC分析純度;根據(jù)公開的專利,采用高錳酸鉀氧化方法制備粗24-COOH-PPD,再用硅膠柱層析得到高純度的24-COOH-PPD,用薄層色譜和HPLC分析純度。實(shí)驗(yàn)2:達(dá)瑪烷類天然產(chǎn)物體外對(duì)CK-MM活性的影響將12個(gè)不同濃度的達(dá)瑪烷類化合物,包括人參皂苷Rgl、Rd和Rh以及達(dá)瑪烷類苷元20(S)-PPD、20(R)-PPD、20(S)-原人參三醇[20(S)-PPT]、人參二醇(PD)、人參三醇(PT)、奧克梯隆(Ocotillol)、25-羥基-原人參二醇(25-OH-PPD)、Jujubogenin和24-COOH-PPD與CK-MM結(jié)合后,通過CK測(cè)定試劑盒來檢測(cè)它們對(duì)CK-MM活性的影響。實(shí)驗(yàn)3:達(dá)瑪烷類天然產(chǎn)物與CK-MM直接相互作用利用BLI技術(shù)測(cè)定上述12個(gè)達(dá)瑪烷類化合物與CK-MM的直接相互作用強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)4:20(S)-PPD與CK-MM的分子對(duì)接利用Schrodinger軟件對(duì)CK-MM和20(S)-PPD進(jìn)行仿真對(duì)接,再用GlideScore工具對(duì)20(S)-PPD在每個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)的對(duì)接形態(tài)進(jìn)行評(píng)分,分析20(S)-PPD與CK-MM的結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合模式。實(shí)驗(yàn)5:突變型與人源型CK-MM的制備采用定點(diǎn)突變技術(shù),以pET10為模板,構(gòu)建了pET11、pET12和pET13質(zhì)粒,再將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21細(xì)胞,表達(dá)帶His標(biāo)簽的CK-MM。最后用HisTrapTM HP柱來純化蛋白,用SDS-PAGE在10%聚丙烯酰胺凝膠上評(píng)估蛋白純度。實(shí)驗(yàn)6:20(S)-PPD與野生型和突變型(Mutant)人源CK-MM親和力的測(cè)定采用ForteBio Octet RED96系統(tǒng)檢測(cè)20(S)-PPD與野生型或三種突變型人源CK-MM的結(jié)合情況。利用ForteBio Data Analysis軟件來分析數(shù)據(jù),獲得結(jié)合常數(shù)(Kon)及解離常數(shù)(Kdis),根據(jù)公式KD=Kdis/Kon計(jì)算出親和力數(shù)值(KD)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)1:利用大孔樹脂吸附法獲得10 g高純度酸棗仁粗皂苷,再通過氧化切割制備出2 g粗Jujubogenin,經(jīng)硅膠柱反復(fù)層析獲得100 mg Jujubogenin,其純度為90.7%;利用高錳酸鉀氧化法制備出150 mg的粗24-COOH-PPD,經(jīng)硅膠柱層析得到30 mg精制的24-COOH-PPD,其純度為90.2%。實(shí)驗(yàn)2:(1)達(dá)瑪烷類苷元對(duì)CK-MM酶活的影響。20(S)-PPD、20(R)-PPD、20(S)-PPT、24-COOH-PPD、25-OH-PPD及PD與兔源CK-MM結(jié)合后能夠提高其酶活,最大激活程度由大到小:20(S)-PPD24-COOH-PPD20(S)-PPT20(R)-PPD25-OH-PPDPD;PT和Ocotillol對(duì)兔源CK-MM的活性無明顯影響;Jujubogenin與酶結(jié)合后反而抑制其活性。(2)人參皂苷及其苷元對(duì)CK-MM酶活的影響。20(S)-PPD、20(S)-PPT和Rh2能夠提高鼠源CK-MM的活性,最大激活程度由大到小:20(S)-PPD20(S)-PPTRh2;Rd和Rg1與CK-MM結(jié)合后,其酶活無明顯改變。實(shí)驗(yàn)3:(1)達(dá)瑪烷類苷元與CK-MM的直接相互作用。在20 μM濃度下,Ocotillol、PT和Juj ubogenin與His標(biāo)簽的CK-MM直接相互作用較弱,而20(S)-PPD、20(R)-PPD、20(S)-PPT、PD、25-OH-PPD及24-COOH-PPD與CK-MM的直接相互作用較明顯。24-COOH-PPD相互作用強(qiáng)度由大到小:20(S)-PPD24-COOH-PPD20(S)-PPPT20(R)-PPD25-OH-PPDPDOcotillolPTJujubogenin。(2)人參皂苷及其苷元與CK-MM的直接相互作用。在20 μM濃度下,Rg1和Rd幾乎與生物素化的CK-MM沒有直接的相互作用。隨著極性和糖分子的減少,Rh2及其苷元[20(S)-PPD和20(S)-PPT]逐漸與CK-MM有直接的相互作用。相互作用程度由大到小:20(S)-PPD20(S)-PPTRh2RglRd。實(shí)驗(yàn)4:FTMap和SiteMap軟件分析發(fā)現(xiàn)人源CK-MM晶體結(jié)構(gòu)表明上有兩個(gè)活性結(jié)合位點(diǎn),除了激酶均具備的ADP結(jié)合位點(diǎn)(Sl")外,還有一個(gè)臨近位點(diǎn)(S2")。20(S)-PPD對(duì)接到S2"位點(diǎn)的構(gòu)象評(píng)分大于與ADP結(jié)合口袋(S1")的對(duì)接評(píng)分。20(S)-PPD可通過2個(gè)負(fù)電性基團(tuán)(3-OH和12-OH)生成3個(gè)氫鍵與S2"位點(diǎn)的氨基酸殘基(Q318、R320和S285)相互作用。實(shí)驗(yàn)5:基于分子對(duì)接預(yù)測(cè)到的位點(diǎn)關(guān)鍵氨基酸(Q318,R320及S285),利用基因定點(diǎn)誘變和蛋白純化技術(shù),制備出三個(gè)突變型人源CK-MM:突變體1(Q318P,318位點(diǎn)的谷氨酰胺突變?yōu)楦彼?、突變體2(R320T,320位的精氨酸突變?yōu)樘K氨酸)和突變體3(S285T,285位的絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸)。實(shí)驗(yàn)6:野生型、突變體1、突變體2和突變體3與20(S)-PPD的KD值分別為2.3 7±0.11E-5M,3.09±0.11E-2 M,5.14±0.13E-4M和9.56±0.10E-5M。野生型與20(S)-PPD結(jié)合后的親和力分別是突變體1、突變體2和突變體3與20(S)-PPD結(jié)合親和力的1300、20和4倍。S2"位點(diǎn)關(guān)鍵氨基酸(R320和S285)的突變均降低了20(S)-PPD與CK-MM的親和力,Q318位點(diǎn)突變幾乎導(dǎo)致20(S)-PPD與CK-MM結(jié)合能力的喪失。結(jié)論1.達(dá)瑪烷類天然產(chǎn)物母核C-3、C-6以及C-20位置連接了糖分子后會(huì)弱化其激活CK-MM的能力以及和CK-MM的相互作用。2.與天然S型構(gòu)象相比,R型構(gòu)象會(huì)降低其與CK-MM的直接相互作用。3.達(dá)瑪烷類苷元側(cè)鏈上形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)以及母核上C-6位置的取代基團(tuán)會(huì)明顯影響到其與CK-MM的結(jié)合以及激活CK-MM的能力。4.達(dá)瑪烷類天然產(chǎn)物母核上的3-OH和12-OH是其與CK-MM直接相互作用的重要化學(xué)基團(tuán),并且3-OH的重要性要高于12-OH。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

４．１邋Ｊｕｊｕｂｏｇｅｎｉｎ邋的制備逡逑對(duì)酸棗仁粗苷元采用硅膠薄層進(jìn)行展開（石油醚：乙酸乙酯＝１：１）邋，邋１０％硫酸乙醇，逡逑１０５邋°Ｃ供干顯色結(jié)果見圖４－２，可見呈藍(lán)色斑點(diǎn)的Ｊｕｊｕｂｏｇｅｎｉｎ；然后，對(duì)酸寒仁粗昔元進(jìn)行逡逑硅膠柱層析分離，共收集了邋５１管洗脫液（８ｍｌ／管），硅膠薄層展開（石油醚：乙酸乙酯＝逡逑１：１）邋，邋１０邋％硫酸乙醇，１０５邋°Ｃ烘干顯色結(jié)果見圖４－３和圖４－４，合并３３－４３洗脫液；最后，逡逑減壓回收洗脫劑，殘?jiān)?jīng)甲醇重結(jié)晶后，硅膠薄層展開（石油醚：乙酸乙酯＝２：１），１０％逡逑硫酸乙醇，１０５邋°Ｃ烘干顯色結(jié)果見圖４－５。精制的Ｊｕｊｕｂｏｇｅｎｉｎ液相色譜圖見圖４－６，面積逡逑歸一化法計(jì)算的純度約為９０．７％。逡逑Y"邐ｍ：邐想邋＿邐ｍ－R猓洌椋椋義賢跡矗菜嵩嬡蝕周趙〔閔淄煎義希叔義希懾義希懾義賢跡矗乘嵩嬡蝕周趙鬮魷賜巖罕〔閔淄跡ǎ保常罰╁義希常村義

本文編號(hào)：2766576