發(fā)布時間：2020-07-22 23:35

【摘要】：目的:肺癌是人類面臨的最常見的惡性腫瘤之一。近年來,肺癌的發(fā)病率迅速上升,占全球所有癌癥病例的十分之一以上,其死亡率亦位居全球癌癥致死首位,嚴(yán)重威脅著人類的健康發(fā)展。盡管根據(jù)組織學(xué)分類,肺癌分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC),但約85%的肺癌患者被診斷為NSCLC。由于當(dāng)前常用的抗肺癌藥物效果欠佳、存在的毒副作用較大以及腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的抗藥性,使得手術(shù)切除仍然是NSCLC最佳的治療選擇。然而,由于NCLSC發(fā)病早期無相關(guān)特異性癥狀,且當(dāng)前對肺癌的發(fā)病分子機(jī)制仍不甚明了,缺乏針對NCLSC的準(zhǔn)確及簡易的早期診斷方法,以至于大多數(shù)肺癌患者被確診時已處于手術(shù)切除已無法救治的病理晚期。因此,深入探究肺癌的發(fā)病分子機(jī)制,尋找新的有效早期篩查、預(yù)后標(biāo)志物以及挖掘安全有效治療肺癌的藥物已是亟不可待。小檗堿(Berberine,BBR)又稱為黃連素,是傳統(tǒng)中藥黃連的主要成分活性成分,廣泛存在于小檗科、防己科、罌粟科等植物當(dāng)中,長期在傳統(tǒng)中藥中被用于治療胃腸道疾病。近年來,小檗堿及其衍生物被證明具有抗腫瘤活性且毒性較低,但其作用機(jī)制仍不明確。8-十六烷基小檗堿(8-BBR-C16,HBBR)是通過向BBR的C8位引入16C直鏈烷基修飾而產(chǎn)生的一種新BBR衍生物,課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其口服吸收率、生物利用度較BBR顯著增高,并且具有較明顯的肺部靶向性,但其是否具有抗肺癌以及其它腫瘤活性仍未有報道。因此,一方面,本研究擬通過生物信息學(xué)的方法,篩選NSCLC相關(guān)差異表達(dá)基因,并通過差異蛋白間相互作用網(wǎng)絡(luò)關(guān)系預(yù)測、核心基因篩選及預(yù)后分析等方面探討非小細(xì)胞肺癌可能的分子機(jī)制。另一方面,通過體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究HBBR對肺癌的抑制作用及其可能的分子機(jī)制。方法和結(jié)果:(1)利用生物信息學(xué)方法以及GEO數(shù)據(jù)庫中的人肺癌組織mRNA表達(dá)芯片數(shù)據(jù)集,我們比較分析了GSE21933、GSE33532、GSE44077和GSE74706數(shù)據(jù)集中NSCLC及其對應(yīng)正常組織mRNA的表達(dá)水平,分別挖掘出差異上調(diào)基因:676、865、274、1797個;差異下調(diào)基因:761、1262、689、2350個;通過對四個芯片數(shù)據(jù)集差異表達(dá)基因取交集,最終獲得差異上調(diào)基因57個以及138個差異下調(diào)基因。通過對差異基因進(jìn)行GO(Gene Ontology)注釋,發(fā)現(xiàn)上調(diào)的差異基因與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分裂、細(xì)胞周期等生物學(xué)過程相關(guān),下調(diào)差異基因與血管生成、細(xì)胞粘附、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程相關(guān)。通過構(gòu)建蛋白與蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò),挖掘出度得分≥19的中心節(jié)點(diǎn)基因25個,其中CCNB1、CCNA2、CEP55、PBK以及HMMR基因得分最高。通過Oncomine的肺癌數(shù)據(jù)庫我們進(jìn)一步對篩選得到的前5名中心節(jié)點(diǎn)基因進(jìn)行了表達(dá)驗(yàn)證,并且通過Kaplan Meier Plotter的肺癌病人數(shù)據(jù)庫進(jìn)行預(yù)后分析后發(fā)現(xiàn)CCNB1、CCNA2、CEP55、PBK以及HMMR的mRNA表達(dá)水平高低與NSCLC的臨床預(yù)后顯著相關(guān),并且其它20個中心節(jié)點(diǎn)基因也與NSCLC的臨床預(yù)后緊密聯(lián)系。(2)參考課題組前期的研究工作,利用格式試劑合成法,將16碳直鏈烷基取代BBR C8位的H合成HBBR。產(chǎn)物經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定,確定為擬研究目標(biāo)產(chǎn)物。(3)為研究HBBR的體外抗肺癌作用,通過MTT方法分析了HBBR對于A549細(xì)胞的活力影響,發(fā)現(xiàn)HBBR較BBR對細(xì)胞活力的抑制作用大大提高,其半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為2.325、27.398μg/ml;通過流式細(xì)胞儀檢測不同濃度HBBR(0、0.2、0.5、1μg/ml)給藥后A549細(xì)胞的周期分布,通過EdU增殖實(shí)驗(yàn)檢測DNA合成以及western blot檢測周期相關(guān)表達(dá)蛋白,發(fā)現(xiàn)HBBR能夠抑制A549細(xì)胞的增殖,并且使其細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期;運(yùn)用流式細(xì)胞儀、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測以及western blot技術(shù),我們發(fā)現(xiàn)HBBR亦能夠通過誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡而實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤作用,并且通過分析HBBR給藥后A549細(xì)胞中CEP55、PI3K、Akt、pAkt、p21、p27的蛋白表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn),HBBR極有可能通過抑制PI3K-Akt信號通路的活性而抑制細(xì)胞生長;同時,通過細(xì)胞劃痕以及transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),HBBR能夠顯著抑制A549細(xì)胞的遷移與侵襲能力。(4)通過在裸鼠右前肢腋下皮下接種A549細(xì)胞建立人肺癌異種移植瘤模型,接種后通過口腔灌胃給藥21天的方式研究HBBR的體內(nèi)抗肺癌效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時,與腫瘤模型組相比,藥物組BBR(120 mg/kg)、HBBR(5 mg/kg)、HBBR(10 mg/kg)的平均離體瘤重分別降低27.47%、34.58%、59.07%。同時,通過腫瘤標(biāo)志物蛋白芯片檢測荷瘤21天后裸鼠的血清腫瘤標(biāo)志物水平,發(fā)現(xiàn)HBBR給藥后,NSE、CYFRA21-1和CA125水平顯著降低。此外,通過檢測給藥期間裸鼠的體重變化以及解剖后各小鼠的臟器系數(shù),發(fā)現(xiàn)HBBR長期給藥對小鼠生長無明顯毒副作用。以上結(jié)果表明,HBBR具有較好的體內(nèi)抑制肺癌生長潛力,并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。(5)腸道內(nèi)微生態(tài)的穩(wěn)定與機(jī)體的健康及對疾病的抵抗能力息息相關(guān),為從腸道微生物的角度探究HBBR抑制人A549肺癌細(xì)胞異種移植瘤生長的可能機(jī)制,收集動物實(shí)驗(yàn)第20天正常對照組、腫瘤模型組、HBBR(10 mg/kg)組小鼠新鮮排泄的糞便,提取糞便中的基因組DNA后,通過16S rRNA基因測序方法,檢測各組腸道菌群的差異。從9個糞便樣本中獲得了685707個有效的焦磷酸測序讀數(shù),總共鑒定了198種微生物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤模型組小鼠體內(nèi)檢測到的微生物種類及豐度均低于正常對照組和HBBR組。表明HBBR的治療有利于維持小鼠體內(nèi)穩(wěn)定和健康的微生態(tài)。在種水平上,本研究首次報道了HBBR給藥有利于維持Clostridium clostridioforme(梭狀梭菌)、Bacteroides acidifaciens(生酸擬桿菌)、Parabacteroides distasonis(迪氏副擬桿菌)、Lactobacillus animalis(動物乳桿菌)、Lactobacillus gasseri(格氏乳桿菌)、Lactococcus lactis(乳酸乳球菌)、Erysipelatoclostridium ramosum(多枝梭菌)以及Mucispirillum schaedleri在荷瘤小鼠腸道內(nèi)的豐度。(6)采用人肺癌A549細(xì)胞荷瘤裸鼠模型和鼠源Lewis肺癌荷瘤模型同時比較HBBR單藥、紫杉醇單藥、紫杉醇聯(lián)合順鉑以及紫杉醇聯(lián)合HBBR對荷瘤小鼠腫瘤生長的作用效果,初步探究HBBR是否可以增強(qiáng)紫杉醇對肺癌細(xì)胞的殺傷作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在A549細(xì)胞荷瘤裸鼠模型中,HBBR(10 mg/kg)每日口腔灌胃給藥聯(lián)合紫杉醇(12 mg/kg)每周注射1次的腫瘤抑制率(62.01%)較紫杉醇、HBBR單藥分別提高18.54%、15.06%;同時在Lewis肺癌荷瘤模型中,該組合的腫瘤抑制率(57.99%)較紫杉醇、HBBR單藥分別提高19.94%、21.66%,由此可見HBBR與紫杉醇聯(lián)合給藥有利于各自藥效的提高。結(jié)論:本研究通過分析非小細(xì)胞肺癌相關(guān)芯片數(shù)據(jù),首次在多個數(shù)據(jù)集中挖掘出了一系列共有表達(dá)的差異基因,通過網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫及工具對差異基因進(jìn)行分析后,發(fā)現(xiàn)NSCLC的發(fā)生與細(xì)胞周期、增殖、凋亡相關(guān)蛋白的異常表達(dá)關(guān)系極為密切。通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn),首次證實(shí)小檗堿的C8位十六烷基取代物即HBBR具有抗肺癌活性且其抑制腫瘤活性與細(xì)胞周期及凋亡密切相關(guān)。通過分析HBBR給藥后荷瘤裸鼠的腸道微生物菌群,發(fā)現(xiàn)HBBR治療有利于維持荷瘤小鼠體內(nèi)健康的腸道微生物環(huán)境。并且通過分析HBBR與紫杉醇單用及聯(lián)合給藥對荷瘤裸鼠模型以及Lewis肺癌細(xì)胞荷瘤小鼠模型皮下瘤組織生長的影響,發(fā)現(xiàn)HBBR聯(lián)合紫衫醇給藥有利于進(jìn)一步提高單藥藥效。
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

圖 1-1 R 軟件（3.4.0 版本）截圖Fig.1-1. The operation interface of R software (version 3.4.0).

圖 1-2 FuRich 軟件（2.1.2 版本）截圖Fig.1-2. The operation interface of FuRich software (version 2.1.2).異基因分析及功能注釋了進(jìn)一步研究非小細(xì)胞肺癌與正常組織之間差異基因的功能，我們使用

圖 1-3 DAVID（6.8 版本）截圖Fig.1-3. The operation interface of online database DAVID (version 6.8). 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建為研究非小細(xì)胞肺癌相對正常組織所發(fā)生的分子機(jī)理異同，我們通過 ST

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