【摘要】：膽固醇結石是一種多因素共同作用的復雜代謝性疾病;全外顯子組測序(Whole exome sequence,WES)作為新一代測序技術,是利用序列捕獲技術將全外顯子區(qū)域的DNA捕捉并富集,然后進行高通量測序的基因組分析技術。WES的目標區(qū)域是包含人類80%基因致病性疾病的蛋白質編碼區(qū)域,對常見和罕見的變異高度靈敏,能夠發(fā)現(xiàn)外顯子區(qū)域絕大部分疾病相關變異。全外顯子測序技術為探尋膽固醇結石可疑致病基因提供了契機。本研究擬以具有遺傳背景的膽固醇結石患者為對象,采用WES技術,經(jīng)過和數(shù)據(jù)庫、過濾器比對結合生物信息學分析篩選出膽固醇結石可疑致病變異基因;通過核心小家系的篩選、Sanger驗證和保守性分析對位點進行驗證;通過動物模型初步驗證可疑致病基因,為膽固醇結石的遺傳學發(fā)病機制研究提供新的線索;柴胡皂苷D(Saikosaponin-d,SSD),是從中藥柴胡提取的中藥單體;具有抗腫瘤、免疫調節(jié)、抗炎、降血脂以及保肝的等藥理學作用;動物實驗中首次將SSD用于膽固醇結石疾病領域,探討SSD預防膽固醇結石的有效性及可能的保護性機制,為治療膽固醇結石的新藥開發(fā)和早期預防提供理論指導。第一部分:全外顯子組測序探尋膽固醇結石致病基因及功能預測目的:本研究以具有遺傳背景的膽囊膽固醇結石患者為研究對象,采用全外顯子組測序探尋與膽固醇結石發(fā)病相關的可疑致病變異基因。方法:以21例家族膽固醇結石患者和5例家系內健康成員為研究對象,收集病例資料。采集外周靜脈血5ml,提取基因組DNA,進行WES,經(jīng)歷嚴格的質量控制系統(tǒng)得到產(chǎn)出數(shù)據(jù)。采用兩種篩選策略進行數(shù)據(jù)分析:(1)基于先驗的脂質代謝相關基因及相關致病性變異,結合文獻檢索對數(shù)據(jù)進行比對和深入挖掘,得到膽固醇結石的可疑致病突變基因。(2)基于家系和所有患病樣本的“Overlap”法,通過次要等位基因頻率(Minor allele frequency,MAF)過濾器和在線軟件SIFT、Mutation Assessor以及Poly Phen2對突變位點進行功能預測;同時對變異基因進行生物信息學分析包括GO(Gene ontology)基因本體功能和《京都基因與基因組百科全書》(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。將基因列表提交到交互基因檢索工具(STRING)數(shù)據(jù)庫,得到基因互作網(wǎng)絡;使用Cytoscape version 3.4.0軟件將基因的相互作用網(wǎng)絡圖可視化,應用插入式分子復合體檢測(MCODE)技術篩選出基因相互作用網(wǎng)絡模塊;結合以上生物信息學分析對得到的突變基因進行文獻檢索查重,最后得到可疑致病變異基因。結果:基于先驗的深入挖掘認為基因LRP2、LRP5、PLTP、OSBPL10、MUC5B、ABCA1、ABCB11和TGR5可能在膽固醇結石的發(fā)病中占據(jù)重要地位;基于“Overlap”篩選原則和生物信息學分析得到PHLPP2、NOTCH1、INTS1、SMARCA4和HUWE1以及泛素介導的蛋白水解途徑和蛋白質消化吸收信號通路可能在膽固醇結石疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。結論:通過WES得到龐大數(shù)目的變異基因,結合篩選策略和生物信息學分析最終定位13個可以致病變異基因(基于先驗的LRP2、LRP5、PLTP、OSBPL10、MUC5B、ABCA1、ABCB11和TGR5;基于“Overlap”篩選的PHLPP2、NOTCH1、INTS1、SMARCA4和HUWE1)以及泛素介導的蛋白水解途徑和蛋白質消化吸收信號通路,這些基因突變和信號通路可能在膽固醇結石的形成中發(fā)揮作用。第二部分:一個膽固醇結石家系的全外顯子組測序及致病基因的定位研究目的:探索一個膽固醇結石家系的可疑致病基因,比對第一章節(jié)的致病變異,驗證結果的準確性。方法:首先通過收集病史資料和腹部超聲對膽固醇結石的家系進行膽結石篩查,并留取6名成員的外周靜脈血提基因組DNA,進行WES,通過質控系統(tǒng)輸出數(shù)據(jù);比對千人計劃數(shù)據(jù)庫、db SNP141和EAS數(shù)據(jù)庫對測序數(shù)據(jù)進行變異篩查,排除數(shù)據(jù)庫中的已知變異保留患者共有并正常人沒有的突變;結合Mutation Assessor、SIFT以及Poly Phen2對致病突變進行預測,選出可能性較大的致病突變基因;運用聚合酶鏈反應擴增和Sanger法將候選致病基因位點(INTS1和SOCS6)在家系內進行共分離驗證,并在Pub Med和Google scholar中檢索、查重以明確是否為新發(fā)變異。結果:在家族性膽石病家系中發(fā)現(xiàn)INTS1基因變異(p.Arg1522His/c.4565GA)與膽固醇結石疾病發(fā)生共分離。該基因變異是一個新發(fā)突變。結論:本家系中發(fā)現(xiàn)并驗證了基因INTS1上新發(fā)的致病突變p.R1522H。WES可以快速準確的鑒定家族性膽固醇結石疾病的致病基因。第三部分:柴胡皂苷D預防膽固醇結石的實驗研究目的:通過建立動物膽固醇結石模型,對先驗挖掘得到的ABCA1、ABCB11和TGR5基因進行PCR驗證;同時觀察柴胡皂苷D(Saikosaponin-d,SSD)對飲食誘導的C57BL/6鼠膽固醇結石形成的影響,檢測ABCA1、ABCB11和TGR5的轉錄水平變化、檢測膽汁成分的變化并進一步探究SSD對LKB1/AMPK信號通路的影響。方法:在動物實驗中,采用高脂高膽固醇飼養(yǎng)法構建C57BL/6膽固醇結石模型。8-10周,雄性C57BL/6小鼠40只,體重18-20g,適應性飼養(yǎng)兩周,采用隨機數(shù)字法分成四組(n=10),正常對照組(N-CON組):常規(guī)飼料喂養(yǎng);模型組(LITH組):高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng);熊去氧膽酸膠囊組(UDCA組):高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng),同時熊去氧膽酸膠囊灌胃處理;柴胡皂苷D組(SSD組):高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng),同時SSD灌胃處理;實驗周期為八周,實驗期間觀察記錄動物一般情況和體重變化。八周后解剖觀察各組動物成石情況,記錄結石率;留取結石,采用紅外光譜觀察溴化鉀壓片法對結石進行定性分析;留取膽汁,對各組膽汁脂質成份膽固醇、膽汁酸和磷脂進行檢測并計算膽固醇飽和指數(shù)(Cholesterol Saturation Index;CSI);肝臟組織進行病理學HE染色對各組肝細胞損傷和脂肪浸潤情況進行分析;肝臟組織提取RNA,采用實時熒光定量RT-PCR檢測各組ABCA1、ABCB11和TGR5基因m RNA相對表達量;提取肝臟組織總蛋白,Western blot方法檢測肝細胞AMPK及上游蛋白LKB1蛋白的活性水平。結果:第八周LITH組體重明顯重于N-CON組,有統(tǒng)計學差異(P0.05),LITH組的結石率為100%,且膽結石成份鑒定為膽固醇結石;UDCA組和SSD組的成石率分別為20%、30%,與LITH組相比明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);膽汁膽固醇和磷脂在LITH組較N-CON組明顯升高(P0.05),膽汁酸在LITH組較N-CON組明顯下降(P0.05);治療后,UDCA組和SSD組膽固醇和磷脂含量較LITH組,明顯下降(P0.05);膽汁酸濃度在UDCA組和SSD組較LITH組有所升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);LITH組CSI大于1,表明膽固醇過飽和膽汁形成,UDCA組和SSD組CSI均小于1,表明SSD和UDCA都能夠緩解過飽和膽汁的生成;蘇木素-伊紅染色(Hematoxylin Eosin;HE)N-CON組未見明顯異常,呈現(xiàn)正常肝組織狀態(tài),LITH組視野可見大量脂肪空泡,脂肪空泡充滿肝細胞胞質可將胞核被擠壓到邊緣,胞核疏松核質比例改變明顯,可見部分可見核脹大、核碎裂甚至雙核現(xiàn)象,肝細胞損傷嚴重;UDCA組和SSD組肝細胞損傷情況較LITH組好轉,病理表現(xiàn)介于N-CON組和LITH組之間。RT-PCR檢測結果顯示ABCA1基因m RNA相對表達水平在N-CON組、LITH組和SSD組,未見明顯沒有差異(P0.05);LITH組ABCB11m RNA較N-CON組表達明顯下降,TGR5m RNA表達在LITH組較N-CON組明顯升高;SSD組ABCB11和TGR5 m RNA相對表達量較LITH組明顯升高(P0.05);Western blot結果表明SSD能夠明顯增加LKB1和AMPK的磷酸化水平。結論:與正常組相比,LITH組ABCA1m RNA水平未見明顯改變,ABCB11m RNA水平明顯下降以及TGR5m RNA明顯升高;SSD能夠改善膽汁的脂質成份,緩解膽固醇過飽和膽汁生成。SSD通過激活LKB1-AMPK信號通路,從而起到預防膽固醇結石形成的作用;其中ABCB11和TGR5可能是效應靶點。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

天津醫(yī)科大學博士學位論文顯子組捕獲，Agilent 公司的全外顯子捕獲試劑盒（Agilent ll Exon v5 kit;50M ）捕獲可達 50Mb。Illumina Hiseq 2000 作.1 基因組 DNA 文庫建立 Agilent v5（50M）捕獲平臺進行全外顯子組捕獲，采用美國對基因組 DNA 樣本制備試劑盒，建立基因組 DNA 文庫。DN圖 1.1。

圖 1.2 全外顯子組測序信息分析流程圖1.1.4.7.3 數(shù)據(jù)過濾器為了確保測序數(shù)據(jù)的質量、去除干擾測序數(shù)據(jù)的異質性噪音， 首先對測序數(shù)據(jù)進行過濾。過濾方法如下：(1) 首先過濾除掉 reads 的接頭序列；(2) 當單端測序結果 reads 內含有低質量堿基數(shù)目超過這條 reads 的一半時，應該刪除這一組 reads；(3) 當單端測序結果 reads 內含有的 N 堿基數(shù)目超過這條 reads 的十分之一時，需要刪除這一組 reads；經(jīng)過過濾器后，得到"Clean data"，并且對測序數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，內容包括測序數(shù)目、數(shù)據(jù)產(chǎn)量和質量值分布等。1.1.4.7.4 原始數(shù)據(jù)比對Burrows-Wheeler Aligner 數(shù)據(jù)比對軟件（BWA V0.7.15)，采用 BWA-MEM的比對方法將 cleanreads 比對到人參考基因組上(GRCh37/HG19)。分別對每一個lane 的測序數(shù)據(jù)比對，并且在比對的結果中添加 read group ID。使用 Picard-

天津醫(yī)科大學博士學位論文C3 296.2 50 14.81 合格，輕微降解H2 45.4 45 2.043 合格，輕微降解H1 92.8 45 4.176 合格，輕微降解H3 87.5 45 3.9375 合格，輕微降解G3 216.7 45 9.7515 合格，輕微降解G2 337.5 45 15.1875 合格，輕微降解G1 174.9 45 7.8705 合格，輕微降解F1 290 45 13.05 合格，輕微降解F4 223.3 45 10.0485 合格，輕微降解E2 210.2 45 9.459 合格，輕微降解E1 207.9 45 9.355 合格，輕微降解

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本文編號：2766178