【摘要】：目的:白術(shù)(Atractylodes)來源于菊科植物白術(shù)干燥根,主產(chǎn)于浙江、安徽、湖北、湖南等地,其性味甘、苦、溫,具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎等功效。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(AtractylenolideⅢ)是白術(shù)的主要成分之一,許多研究發(fā)現(xiàn),白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ具有明顯的抗炎、抗腫瘤作用,但其能否抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖,能否誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡尚不清楚。本研究以人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞作為研究對(duì)象,觀察白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)該腫瘤細(xì)胞增殖的作用,并探討其對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡的影響及分子機(jī)制,旨在闡明其抗腫瘤作用機(jī)制,為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在腫瘤治療,特別是臨床應(yīng)用于結(jié)腸癌的治療提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ體外抗腫瘤活性篩選:CCK-8法檢測(cè)不同濃度的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、人肝癌細(xì)胞HePG2、腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12、人胰腺癌細(xì)胞Panc-28、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116等腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。(2)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ干預(yù)濃度及作用時(shí)間的篩選:選擇一定濃度梯度白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(6.25、12.5、25、50、100、200μmol/L)分別處理HCT-116細(xì)胞12 h、24 h、48 h,采用CCK-8法檢測(cè)其細(xì)胞增殖的抑制作用,篩選白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的干預(yù)濃度及最佳作用時(shí)間。(3)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)HCT-116細(xì)胞體外抗腫瘤活性的測(cè)定:具體將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組采用0.5μg/mL 5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組(50、100、200μmol/L)。常規(guī)培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞后,陰性對(duì)照組不做處理,陽性對(duì)照組采用0.5μg/mL 5-氟尿嘧啶處理24 h,白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組分別采用50、100、200μmol/L濃度的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理腫瘤細(xì)胞24 h,利用CCK-8法檢測(cè)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖的影響。(4)Hoechst 33258染色檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡的影響:將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組(5-FU,0.5μg/mL)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組(50、100、200μmol/L)。常規(guī)培養(yǎng)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞于六孔板中,陰性對(duì)照組不做處理,陽性對(duì)照組采用0.5μg/mL 5-FU處理24 h,白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組分別采用50、100、200μmol/L濃度的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理細(xì)胞24 h,采用Hoechst33258染色對(duì)細(xì)胞核著色,根據(jù)亮藍(lán)色細(xì)胞比例分析結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡變化;(5)Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)分析白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡率的影響:將腫瘤細(xì)胞分為陰性對(duì)照組,陽性對(duì)照組(5-FU,0.5μg/mL)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組(50、100、200μmol/L)。常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞于六孔板中,陰性對(duì)照組不做處理,陽性對(duì)照組采用0.5μg/mL 5-FU處理24 h,白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組分別采用50、100、200μmol/L濃度的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理腫瘤細(xì)胞24 h,按照試劑盒步驟處理細(xì)胞,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率以分析各濃度白術(shù)內(nèi)酯對(duì)HCT-116細(xì)胞凋亡作用;(6)RT-PCR測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞后凋亡相關(guān)基因(Bax,Bcl-2,caspase-3,caspase-9)的表達(dá)水平:將腫瘤細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組(5-FU,0.5μg/mL)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組(50、100、200μmol/L)。常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞于六孔板中,陰性對(duì)照組不做處理,陽性對(duì)照組采用0.5μg/mL 5-FU處理24h,白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組分別采用50、100、200μmol/L濃度的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理腫瘤細(xì)胞24 h,按照試劑說明書步驟處理細(xì)胞,采用Bio-rad實(shí)時(shí)定量PCR儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)水平;(7)Western blot法檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白(Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9)表達(dá)的變化:將腫瘤細(xì)胞分為陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組(5-FU,0.5μg/mL)、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組(50、100、200μmol/L)。常規(guī)培養(yǎng)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞于六孔板中,陰性對(duì)照組不做處理,陽性對(duì)照組采用0.5μg/mL 5-FU處理24 h,白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ組分別采用50、100、200μmol/L濃度的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理腫瘤細(xì)胞24 h,按照試劑說明書步驟提取細(xì)胞蛋白,電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育一抗二抗,最后采用ECL化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)PVDF膜上細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平,并用Bio-rad ChemiDoc?XRS+凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像,Image J軟件分析灰度值。結(jié)果:(1)體外抗腫瘤活性篩選:與對(duì)照組比較,不同濃度白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(25、50、100、200μmol/L)對(duì)HePG2、Panc-28以及A549等腫瘤細(xì)胞活力無明顯的抑制作用;白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ100、200μmol/L濃度干預(yù)PC12腫瘤細(xì)胞,可輕度抑制該細(xì)胞的增殖,但與對(duì)照組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ各濃度(25、50、100、200μmol/L)干預(yù)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞后,細(xì)胞生長抑制率分別增加至16.71±1.38%、17.33±1.08%、34.55±3.14%、73.98±2.95%,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ干預(yù)濃度及作用時(shí)間的篩選:與對(duì)照組比較,白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ各濃度(6.25、12.5、25、50、100μmol/L)處理HCT-116細(xì)胞12 h后細(xì)胞增殖無明顯變化,白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ200μmol/L處理HCT-116細(xì)胞12 h后細(xì)胞生長抑制率輕微增加,差異無顯著性(P0.05);白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ6.25、12.5、25μmol/L處理HCT-116細(xì)胞24 h,細(xì)胞活力無明顯變化,白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ50、100、200μmol/L處理細(xì)胞24 h,細(xì)胞生長抑制率顯著增加,與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ各濃度(6.25、12.5、25、50、100、200μmol/L)處理HCT-116細(xì)胞48 h,與對(duì)照組比較,細(xì)胞生長抑制率顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。結(jié)果表明,后續(xù)實(shí)驗(yàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可采用干預(yù)濃度為50、100、200μmol/L進(jìn)行,最佳作用時(shí)間為24 h。(3)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)HCT-116細(xì)胞體外抗腫瘤活性的測(cè)定:CCK-8法檢測(cè)結(jié)果表明,與陰性對(duì)照組比較,陽性對(duì)照組(5-FU,0.5μg/mL)以及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ各濃度組(50、100、200μmol/L)處理HCT-116細(xì)胞24 h,細(xì)胞生長抑制率顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)Hoechst 33258染色檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡的影響:陽性對(duì)照組(5-FU,0.5μg/mL)以及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ各濃度組(50、100、200μmol/L)處理HCT-116細(xì)胞24 h,細(xì)胞核呈現(xiàn)亮藍(lán)色的細(xì)胞比例顯著增加,提示凋亡細(xì)胞增加,并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,與陰性對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)Annexin V-FITC流式細(xì)胞術(shù)分析白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡率的影響:陽性對(duì)照組(5-FU,0.5μg/mL)以及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ各濃度組(50、100、200μmol/L)處理HCT-116細(xì)胞24 h,細(xì)胞凋亡率明顯增加,與陰性對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)RT-PCR測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞后凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響:陽性對(duì)照組(5-FU,0.5μg/mL)以及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ各濃度組(50、100、200μmol/L)處理HCT-116細(xì)胞24 h,促凋亡基因Bax、caspase-9、caspase-3表達(dá)水平顯著增加,抑凋亡基因Bcl-2表達(dá)水平明顯降低,與陰性對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(7)Western blot法檢測(cè)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ處理結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響:陽性對(duì)照組(5-FU,0.5μg/mL)以及白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ各濃度組(50、100、200μmol/L)處理HCT-116細(xì)胞24 h,促凋亡蛋白Bax、caspase-9、cleaved caspase-3表達(dá)水平顯著增加,抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平明顯降低,與陰性對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:(1)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ對(duì)HePG2、Panc-28、A549、PC12等細(xì)胞增殖無明顯抑制作用,但對(duì)人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞增殖具有較強(qiáng)的體外抗腫瘤活性,最佳干預(yù)濃度為50、100、200μmol/L,最佳作用時(shí)間為24 h。(2)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ能明顯抑制HCT-116細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡,呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。(3)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可能通過調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2凋亡信號(hào)通路,促進(jìn)Bax、caspase-9、caspase-3等基因及Bax、caspase-9、cleaved caspase-3等蛋白表達(dá),抑制Bcl-2基因及蛋白表達(dá),從而促進(jìn)HCT-116細(xì)胞發(fā)生凋亡。
【學(xué)位授予單位】：西南醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285

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本文編號(hào)：2765329