發(fā)布時間：2020-07-22 04:31

【摘要】：目的:白術(Atractylodes)來源于菊科植物白術干燥根,主產于浙江、安徽、湖北、湖南等地,其性味甘、苦、溫,具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎等功效。白術內酯Ⅲ(AtractylenolideⅢ)是白術的主要成分之一,許多研究發(fā)現,白術內酯Ⅲ具有明顯的抗炎、抗腫瘤作用,但其能否抑制結腸癌細胞的增殖,能否誘導腫瘤細胞凋亡尚不清楚。本研究以人結腸癌HCT-116細胞作為研究對象,觀察白術內酯Ⅲ對該腫瘤細胞增殖的作用,并探討其對HCT-116細胞凋亡的影響及分子機制,旨在闡明其抗腫瘤作用機制,為白術內酯Ⅲ在腫瘤治療,特別是臨床應用于結腸癌的治療提供科學的實驗依據。方法:(1)白術內酯Ⅲ體外抗腫瘤活性篩選:CCK-8法檢測不同濃度的白術內酯Ⅲ對人肺癌細胞A549、人肝癌細胞HePG2、腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12、人胰腺癌細胞Panc-28、人結腸癌細胞HCT-116等腫瘤細胞增殖的抑制作用。(2)白術內酯Ⅲ干預濃度及作用時間的篩選:選擇一定濃度梯度白術內酯Ⅲ(6.25、12.5、25、50、100、200μmol/L)分別處理HCT-116細胞12 h、24 h、48 h,采用CCK-8法檢測其細胞增殖的抑制作用,篩選白術內酯Ⅲ的干預濃度及最佳作用時間。(3)白術內酯Ⅲ對HCT-116細胞體外抗腫瘤活性的測定:具體將細胞分為陰性對照組、陽性對照組采用0.5μg/mL 5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU)、白術內酯Ⅲ組(50、100、200μmol/L)。常規(guī)培養(yǎng)腫瘤細胞后,陰性對照組不做處理,陽性對照組采用0.5μg/mL 5-氟尿嘧啶處理24 h,白術內酯Ⅲ組分別采用50、100、200μmol/L濃度的白術內酯Ⅲ處理腫瘤細胞24 h,利用CCK-8法檢測結腸癌HCT-116細胞增殖的影響。(4)Hoechst 33258染色檢測白術內酯Ⅲ對結腸癌HCT-116細胞凋亡的影響:將細胞分為陰性對照組、陽性對照組(5-FU,0.5μg/mL)、白術內酯Ⅲ組(50、100、200μmol/L)。常規(guī)培養(yǎng)人結腸癌HCT-116細胞于六孔板中,陰性對照組不做處理,陽性對照組采用0.5μg/mL 5-FU處理24 h,白術內酯Ⅲ組分別采用50、100、200μmol/L濃度的白術內酯Ⅲ處理細胞24 h,采用Hoechst33258染色對細胞核著色,根據亮藍色細胞比例分析結腸癌HCT-116細胞凋亡變化;(5)Annexin V-FITC流式細胞術分析白術內酯Ⅲ對人結腸癌HCT-116細胞凋亡率的影響:將腫瘤細胞分為陰性對照組,陽性對照組(5-FU,0.5μg/mL)白術內酯Ⅲ組(50、100、200μmol/L)。常規(guī)培養(yǎng)結腸癌HCT-116細胞于六孔板中,陰性對照組不做處理,陽性對照組采用0.5μg/mL 5-FU處理24 h,白術內酯Ⅲ組分別采用50、100、200μmol/L濃度的白術內酯Ⅲ處理腫瘤細胞24 h,按照試劑盒步驟處理細胞,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率以分析各濃度白術內酯對HCT-116細胞凋亡作用;(6)RT-PCR測定白術內酯Ⅲ處理人結腸癌HCT-116細胞后凋亡相關基因(Bax,Bcl-2,caspase-3,caspase-9)的表達水平:將腫瘤細胞分為陰性對照組、陽性對照組(5-FU,0.5μg/mL)、白術內酯Ⅲ組(50、100、200μmol/L)。常規(guī)培養(yǎng)結腸癌HCT-116細胞于六孔板中,陰性對照組不做處理,陽性對照組采用0.5μg/mL 5-FU處理24h,白術內酯Ⅲ組分別采用50、100、200μmol/L濃度的白術內酯Ⅲ處理腫瘤細胞24 h,按照試劑說明書步驟處理細胞,采用Bio-rad實時定量PCR儀檢測細胞凋亡相關基因的表達水平;(7)Western blot法檢測白術內酯Ⅲ處理人結腸癌HCT-116細胞后凋亡相關蛋白(Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-9)表達的變化:將腫瘤細胞分為陰性對照組、陽性對照組(5-FU,0.5μg/mL)、白術內酯Ⅲ組(50、100、200μmol/L)。常規(guī)培養(yǎng)結腸癌HCT-116細胞于六孔板中,陰性對照組不做處理,陽性對照組采用0.5μg/mL 5-FU處理24 h,白術內酯Ⅲ組分別采用50、100、200μmol/L濃度的白術內酯Ⅲ處理腫瘤細胞24 h,按照試劑說明書步驟提取細胞蛋白,電泳、轉膜、孵育一抗二抗,最后采用ECL化學發(fā)光儀檢測PVDF膜上細胞凋亡相關蛋白表達水平,并用Bio-rad ChemiDoc?XRS+凝膠成像系統獲取圖像,Image J軟件分析灰度值。結果:(1)體外抗腫瘤活性篩選:與對照組比較,不同濃度白術內酯Ⅲ(25、50、100、200μmol/L)對HePG2、Panc-28以及A549等腫瘤細胞活力無明顯的抑制作用;白術內酯Ⅲ100、200μmol/L濃度干預PC12腫瘤細胞,可輕度抑制該細胞的增殖,但與對照組比較,差異無統計學意義。白術內酯Ⅲ各濃度(25、50、100、200μmol/L)干預人結腸癌HCT-116細胞后,細胞生長抑制率分別增加至16.71±1.38%、17.33±1.08%、34.55±3.14%、73.98±2.95%,與對照組比較,差異有統計學意義。(2)白術內酯Ⅲ干預濃度及作用時間的篩選:與對照組比較,白術內酯Ⅲ各濃度(6.25、12.5、25、50、100μmol/L)處理HCT-116細胞12 h后細胞增殖無明顯變化,白術內酯Ⅲ200μmol/L處理HCT-116細胞12 h后細胞生長抑制率輕微增加,差異無顯著性(P0.05);白術內酯Ⅲ6.25、12.5、25μmol/L處理HCT-116細胞24 h,細胞活力無明顯變化,白術內酯Ⅲ50、100、200μmol/L處理細胞24 h,細胞生長抑制率顯著增加,與對照組比較,差異有統計學意義(P0.05);白術內酯Ⅲ各濃度(6.25、12.5、25、50、100、200μmol/L)處理HCT-116細胞48 h,與對照組比較,細胞生長抑制率顯著增加,差異有統計學意義(P0.05),并呈現一定的濃度依賴性。結果表明,后續(xù)實驗白術內酯Ⅲ可采用干預濃度為50、100、200μmol/L進行,最佳作用時間為24 h。(3)白術內酯Ⅲ對HCT-116細胞體外抗腫瘤活性的測定:CCK-8法檢測結果表明,與陰性對照組比較,陽性對照組(5-FU,0.5μg/mL)以及白術內酯Ⅲ各濃度組(50、100、200μmol/L)處理HCT-116細胞24 h,細胞生長抑制率顯著增加,差異有統計學意義(P0.05)。(4)Hoechst 33258染色檢測白術內酯Ⅲ對結腸癌HCT-116細胞凋亡的影響:陽性對照組(5-FU,0.5μg/mL)以及白術內酯Ⅲ各濃度組(50、100、200μmol/L)處理HCT-116細胞24 h,細胞核呈現亮藍色的細胞比例顯著增加,提示凋亡細胞增加,并呈現一定的濃度依賴性,與陰性對照組比較,差異有統計學意義(P0.05)。(5)Annexin V-FITC流式細胞術分析白術內酯Ⅲ對結腸癌HCT-116細胞凋亡率的影響:陽性對照組(5-FU,0.5μg/mL)以及白術內酯Ⅲ各濃度組(50、100、200μmol/L)處理HCT-116細胞24 h,細胞凋亡率明顯增加,與陰性對照組比較,差異有統計學意義(P0.05)。(6)RT-PCR測定白術內酯Ⅲ處理結腸癌HCT-116細胞后凋亡相關基因表達的影響:陽性對照組(5-FU,0.5μg/mL)以及白術內酯Ⅲ各濃度組(50、100、200μmol/L)處理HCT-116細胞24 h,促凋亡基因Bax、caspase-9、caspase-3表達水平顯著增加,抑凋亡基因Bcl-2表達水平明顯降低,與陰性對照組比較,差異有統計學意義(P0.05)。(7)Western blot法檢測白術內酯Ⅲ處理結腸癌HCT-116細胞后凋亡相關蛋白表達的影響:陽性對照組(5-FU,0.5μg/mL)以及白術內酯Ⅲ各濃度組(50、100、200μmol/L)處理HCT-116細胞24 h,促凋亡蛋白Bax、caspase-9、cleaved caspase-3表達水平顯著增加,抑凋亡蛋白Bcl-2表達水平明顯降低,與陰性對照組比較,差異有統計學意義(P0.05)。結論:(1)白術內酯Ⅲ對HePG2、Panc-28、A549、PC12等細胞增殖無明顯抑制作用,但對人結腸癌HCT-116細胞增殖具有較強的體外抗腫瘤活性,最佳干預濃度為50、100、200μmol/L,最佳作用時間為24 h。(2)白術內酯Ⅲ能明顯抑制HCT-116細胞增殖,誘導其凋亡,呈現出一定的濃度依賴性。(3)白術內酯Ⅲ可能通過調節(jié)Bax/Bcl-2凋亡信號通路,促進Bax、caspase-9、caspase-3等基因及Bax、caspase-9、cleaved caspase-3等蛋白表達,抑制Bcl-2基因及蛋白表達,從而促進HCT-116細胞發(fā)生凋亡。
【學位授予單位】：西南醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2765329