氧化苦參堿對阿戈美拉汀誘導(dǎo)肝細胞損傷的保護作用及其機制研究

發(fā)布時間：2020-07-22 02:59

【摘要】：目的:1.觀察阿戈美拉汀(Agomelatine,AMT)對L02肝細胞的損傷作用并探討其機制。2.觀察氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)對阿戈美拉汀誘導(dǎo)L02肝細胞損傷的保護作用并探討其機制。方法:1.觀察阿戈美拉汀對L02肝細胞的損傷作用給予不同濃度的阿戈美拉汀后,在不同時間點觀察藥物對L02肝細胞的損傷作用。(1)CCK-8檢測阿戈美拉汀對L02肝細胞活力的影響。(2)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)檢測阿戈美拉汀對L02肝細胞損傷程度的影響。(3)流式細胞術(shù)檢測阿戈美拉汀對L02肝細胞凋亡的影響。2.探討阿戈美拉汀對L02肝細胞的損傷作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum,ER)應(yīng)激的關(guān)系(1)給予50μM的阿戈美拉汀后,在不同時間點觀察,阿戈美拉汀對L02肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的作用。Western blot檢測p-AKT以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP,p-IRE1α,ATF6,CHOP和p-eIF2α的變化。(2)給予不同濃度的阿戈美拉汀后,在24 h觀察,阿戈美拉汀對L02肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的作用。Western blot檢測p-AKT以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP,p-IRE1α,ATF6,CHOP和p-eIF2α的變化。(3)預(yù)孵育2.5,5,10 nM的PERK通路抑制劑ISRIB 1 h后,給予L02肝細胞50μM阿戈美拉汀24 h,CCK-8檢測L02肝細胞活力。3.觀察氧化苦參堿對阿戈美拉汀誘導(dǎo)L02肝細胞損傷的保護作用預(yù)孵育0.5,1,2μM的氧化苦參堿18 h后,給予L02肝細胞50μM阿戈美拉汀24 h。(1)CCK-8檢測氧化苦參堿對阿戈美拉汀誘導(dǎo)L02肝細胞損傷的細胞活力的影響。(2)ALT和AST檢測氧化苦參堿對阿戈美拉汀誘導(dǎo)L02肝細胞損傷的細胞損傷程度的影響。(3)流式細胞術(shù)檢測氧化苦參堿對阿戈美拉汀誘導(dǎo)L02肝細胞損傷的細胞凋亡的影響。(4)TUNEL染色檢測氧化苦參堿對阿戈美拉汀誘導(dǎo)L02肝細胞損傷的細胞凋亡的影響。4.探討氧化苦參堿對阿戈美拉汀誘導(dǎo)L02肝細胞損傷的保護作用與CHOP蛋白的關(guān)系(1)預(yù)孵育0.5,1,2μM的氧化苦參堿18 h后,給予L02肝細胞50μM的阿戈美拉汀24 h。Western blot檢測BIP,p-IRE1α,ATF6,CHOP和p-AMPKα的變化。(2)細胞熱遷移法檢測氧化苦參堿對AKT蛋白的熱穩(wěn)定作用。(3)SURFLEXDOCK軟件計算氧化苦參堿和AMPK蛋白的分子對接打分。(4)分別給予L02肝細胞1μM MG132,25μM CQ和50 nM BafA1 1 h。Western blot檢測CHOP蛋白的變化。(5)預(yù)孵育0.5,1,2μM的氧化苦參堿18 h,給予L02肝細胞50μM阿戈美拉汀之前,給予1μM MG132處理1 h。Western blot檢測CHOP蛋白的變化。結(jié)果:1.阿戈美拉汀對L02肝細胞的損傷作用(1)CCK-8結(jié)果表明,與對照組相比,給予L02肝細胞高于100μM的阿戈美拉汀12 h,細胞存活率顯著降低;給予L02肝細胞高于50μM的阿戈美拉汀24 h,細胞存活率顯著降低;給予L02肝細胞高于10μM的阿戈美拉汀48 h,細胞存活率顯著降低。(2)ALT和AST結(jié)果表明,與對照組相比,給予L02肝細胞高于50μM的阿戈美拉汀24 h,ALT和AST的絕對值顯著升高;給予L02肝細胞高于20μM的阿戈美拉汀48 h,ALT和AST的絕對值顯著升高。(3)流式細胞術(shù)結(jié)果表明,給予L02肝細胞高于20μM的阿戈美拉汀24 h,與對照組相比,細胞凋亡率顯著升高。2.阿戈美拉汀對L02肝細胞的損傷作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的關(guān)系(1)Western blot結(jié)果表明,與對照組相比,給予L02肝細胞50μM濃度的阿戈美拉汀24 h,BIP,p-IRE1α,ATF6和CHOP蛋白顯著升高,p-AKT蛋白顯著降低,p-eIF2α蛋白無顯著變化。(2)Western blot結(jié)果表明,與對照組相比,給予L02肝細胞高于50μM的阿戈美拉汀24 h,BIP,p-IRE1α,ATF6和CHOP蛋白顯著升高,p-AKT蛋白顯著降低,p-eIF2α蛋白無顯著變化。(3)CCK-8結(jié)果表明,給予L02肝細胞2.5,5,10 nM的PERK通路抑制劑ISRIB,與阿戈美拉汀實驗組相比,細胞存活率無顯著變化。3.氧化苦參堿對阿戈美拉汀誘導(dǎo)L02肝細胞損傷的保護作用(1)CCK-8結(jié)果表明,給予L02肝細胞0.5,1,2μM的氧化苦參堿18 h,與模型組相比,細胞存活率顯著升高。(2)ALT和AST檢測結(jié)果表明,給予L02肝細胞0.5,1,2μM的氧化苦參堿,與模型組相比,ALT和AST絕對值顯著降低。(3)流式細胞術(shù)結(jié)果表明,給予L02肝細胞2μM的氧化苦參堿18 h,與模型組相比,細胞凋亡率顯著降低。(4)TUNEL染色結(jié)果表明,給予L02肝細胞1,2μM的氧化苦參堿18 h,與模型組相比,細胞凋亡率顯著降低。4.氧化苦參堿對阿戈美拉汀誘導(dǎo)L02肝細胞損傷的保護作用與CHOP蛋白的關(guān)系(1)Western blot結(jié)果表明,給予L02肝細胞1,2μM的氧化苦參堿18 h,與模型組相比,只有CHOP蛋白水平顯著降低,而BIP,p-IRE1α和ATF6蛋白水平無顯著變化。(2)細胞熱遷移結(jié)果表明,氧化苦參堿未能保持AKT蛋白的熱穩(wěn)定性。(3)SURFLEX-DOCK結(jié)果表明,氧化苦參堿和AMPK蛋白的結(jié)合力,遠低于其激動劑A-769662和抑制劑PKA的結(jié)合力。(4)Western blot結(jié)果表明,與對照組相比,MG132可顯著升高CHOP蛋白,而CQ和BafA1對CHOP蛋白沒有影響。(5)Western blot結(jié)果表明,與模型組相比,給予2μM的氧化苦參堿18 h,CHOP蛋白水平顯著降低,而MG132可逆轉(zhuǎn)氧化苦參堿對CHOP蛋白水平的降低。結(jié)論:1.阿戈美拉汀對L02肝細胞有損傷作用。2.阿戈美拉汀通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的IRE1α-CHOP和ATF6-CHOP通路誘導(dǎo)L02肝細胞損傷。3.氧化苦參堿對阿戈美拉汀誘導(dǎo)的L02肝細胞損傷有保護作用。4.氧化苦參堿經(jīng)由蛋白酶體途徑降解CHOP蛋白,從而對阿戈美拉汀誘導(dǎo)的L02肝細胞損傷起到保護作用。
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

肝細胞,活力,損傷作用,學(xué)位論文

士學(xué)位論文結(jié)果對 L02 肝細胞的損傷作用對 L02 肝細胞活力的影響肝細胞不同劑量（10, 20, 50, 100, 200 μM）的阿戈（12,24,48h）觀察藥物對肝細胞的損傷作用。CC 100μM 的阿戈美拉汀 12h 后，L02 肝細胞的存活）；給予大于 50μM 的阿戈美拉汀 24h 后，L02 肝低（p<0.05）；給予大于 10 μM 的阿戈美拉汀 48 h照組顯著降低（p<0.001），見圖 1A。

凋亡,對照組,肝細胞,肝細胞損傷

圖 2. 阿戈美拉汀對 L02 肝細胞損傷程度的影響（，n=7）（注：A, B：ALT 檢測圖；C, D：AST 檢測圖；*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001,與對照組相比）1.3 阿戈美拉汀對 L02 肝細胞凋亡的影響分別給予 L02 肝細胞不同劑量（10,20,50,100μM）的阿戈美拉汀后，在 24h 觀察藥物對肝細胞的損傷作用。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，給予 20μM 阿戈美拉汀 24h 后，L02 肝細胞的凋亡率（26.06±2.21%）較對照組（12.95±2.20%）顯著升高（p<0.05）；給予 50 μM 阿戈美拉汀 24 h 后，L02 肝細胞的凋亡率（38.30±2.60%）較對照組（12.95±2.20%）顯著升高（p<0.001）；給予 100μM 阿戈美拉汀 24h 后，L02 肝細胞的凋亡率（43.33±2.35%）較對照組（12.95±2.20%）顯著升高（p<0.001），見圖 3A, B。

氧化苦參堿對阿戈美拉汀誘導(dǎo)肝細胞損傷的保護作用及其機制研究