【摘要】：目的:桑椹(Fructus Mori)作為中國傳統(tǒng)的藥食兩用中藥藥材,是�？浦参锷５母稍锕�,其多糖含量較高。近年來,越來越多的研究證明了大分子多糖的多種藥理作用。本論文從大分子多糖入手,研究桑椹多糖的結(jié)構(gòu)及其對腸道菌群和Aβ_(42)聚集的影響,以及桑椹多糖硫酸化衍生物抗血管生成的活性。嘗試從多糖的結(jié)構(gòu)與活性去研究中藥桑椹,以期為桑椹基于多糖的物質(zhì)基礎(chǔ)和相關(guān)保健品及創(chuàng)新藥物的研究奠定基礎(chǔ)。方法:本論文利用干燥桑椹通過酶(纖維素酶、淀粉酶、木瓜蛋白酶)聯(lián)水提的方法提取桑椹粗多糖(FMP)。粗多糖FMP依次經(jīng)DEAE-Fast Flow和Sephacryl S-300HR和Sephacryl S-100 HR分離純化。將純化所得的桑椹多糖經(jīng)高效凝膠滲透色譜(HPGPC)分析純度及其相對分子量。經(jīng)3-甲基-1-苯基-2-吡啶啉酮(PMP)衍生法和糖醇乙酸酯衍生法分析其單糖組成,甲基化方法分析其糖殘基連接方式、Conrad法進(jìn)行糖醛酸還原,用三氟乙酸(TFA)進(jìn)行部分酸水解,結(jié)合紅外圖譜(IR)、核磁共振(NMR)等多種方法確定多糖的結(jié)構(gòu)。本論文采用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)對腸道擬桿菌(多形擬桿菌、卵形擬桿菌和脆弱擬桿菌)進(jìn)行培養(yǎng),研究桑椹多糖對腸道擬桿菌株的生長影響;以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染淀粉樣蛋白Aβ_(42)前體蛋白APP和β-分泌酶1-BACE1的中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO/APPBACE1)和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Aβ_(42)前體蛋白APP的Swetish突變HEK293-APPsw細(xì)胞為主要的細(xì)胞模型,研究多糖對淀粉樣蛋白Aβ_(42)生成的影響;采用硫磺素T結(jié)合實(shí)驗(yàn)測定桑椹多糖對Aβ_(42)聚集的影響;用MTT方法檢測桑椹多糖對人正常肝細(xì)胞LO_2的毒性;采用氯磺酸-吡啶法(1:3)對桑椹多糖進(jìn)行硫酸化衍生。人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)在基質(zhì)膠上的管腔形成實(shí)驗(yàn)用來考察桑椹多糖硫酸化衍生物的抗血管生成能力。結(jié)果:從桑椹中,提取得到桑椹粗多糖FMP(152 g,產(chǎn)率為15.2%)。繼續(xù)分離純化得到6種均一多糖FMP-2(500 mg,相對于原藥材得率為0.05%)、FMP-5(4.67 g,得率為0.47%)、FMP-6-H(15.56 g,得率為1.56%)、FMP-6-S1(600 mg,得率為0.06%)、FMP-6-S2(2.5 g,得率為0.25%)和FMP-6-S4(1.71 g,得率為0.17%),HPGPC分析表明上述6種多糖都為均一多糖,分子量分別為12.6 kD、17.6 kD、17.5 kD、327.1kDa、86.83 kDa和11.23 kDa。對其中4個均一多糖(FMP-6-S2,FMP-6-S4,FMP-6-S1,FMP-6-H)進(jìn)行詳細(xì)的結(jié)構(gòu)解析。FMP-6-S2的糖組成結(jié)果顯示其由鼠李糖(Rha)、半乳糖醛酸(GalA)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)組成,摩爾比為30.86:24.78:28.70:15.61。結(jié)合甲基化和核磁共振圖譜結(jié)果分析,發(fā)現(xiàn)多糖FMP-6-S2為RG-I型多糖,其主鏈由1,4-α-D-GalpA與1,2-α-L-Rhap交替連接而成,支鏈由末端(Terminal)T-β-D-Galp,1,4-β-D-Galp,1,3,6-β-D-Galp,T-α-L-Araf和1,5-α-L-Araf構(gòu)成;支鏈取代在鼠李糖的C-4位。FMP-6-S4為一個蛋白聚糖,主要由80%的多糖與20%的蛋白質(zhì)組成,其中FMP-6-S4的多糖主要由半乳糖醛酸,阿拉伯糖,半乳糖,葡萄糖和鼠李糖組成,其摩爾比為62.13:4.50:3.70:3.87:5.80。通過氨基酸自動分析儀測出蛋白聚糖FMP-6-S4中的主要氨基酸成分有天冬氨酸,谷氨酸,甘氨酸,精氨酸,亮氨酸和脯氨酸,其摩爾比為4.33:7.27:1.77:1.99:1.61:3.11。蛋白聚糖FMP-6-S4中多糖的結(jié)構(gòu)單元是以1→4連接的α-D-GalpA與1→2連接的α-L-Rhap為主鏈,而在α-D-GalpA的C-3位上被己烯糖醛酸(α-L-HexpA)和β-D-GalpA取代,在α-L-Rhap的C-4位上被α-L-Araf、1,5-α-L-Araf、β-D-Galp或β-D-Glcp、1,6-β-D-Glcp殘基取代。糖組成分析結(jié)果表明FMP-6-S1由鼠李糖、半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖組成,其摩爾比為19.02:17.86:38.05:20.54:3.03:1.5。結(jié)合甲基化連接方式和核磁共振分析,結(jié)果表明FMP-6-S1與多糖FMP-6-S2類似,都為果膠類RG-I型多糖,但其分支結(jié)構(gòu)不同,主鏈由1,4-α-D-GalpA與1,2-α-L-Rhap交替連接構(gòu)成,在1,2-α-L-Rhap的C4位有支鏈,FMP-6-S1的支鏈由T-β-D-Galp(或Glcp),T-β-D-GlcAp,1,4,6-β-D-Galp,1,6-β-D-Galp,1,3-β-D-Galp,1,4-β-D-Galp,T-α-L-Araf和1,5-α-L-Araf構(gòu)成。糖組成結(jié)果顯示FMP-6-H主要由半乳糖醛酸(93.52%)及痕量的阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖和甘露糖組成,還原后甲基化分析表明其半乳糖醛酸的連接方式全部為1,4-連接,可直接推測FMP-6-H為一直鏈半乳糖醛酸聚糖。腸道菌群活性測試結(jié)果表明FMP-6-S2及其降解產(chǎn)物FMP-6-S2-01a可以促進(jìn)有益菌多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的生長,進(jìn)一步的研究表明多形擬桿菌可利用桑椹多糖FMP-6-S2或FMP-6-S2-01a產(chǎn)生短鏈脂肪酸乙酸和丁酸,短鏈脂肪酸不僅是腸道細(xì)菌的能量來源也可以為腸道粘膜細(xì)胞提供能量,對維持腸道穩(wěn)態(tài)及機(jī)體免疫調(diào)節(jié)有重要的調(diào)控作用。抗Aβ_(42)產(chǎn)生與聚集活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,蛋白聚糖FMP-6-S4不但可以抑制Aβ_(42)聚集,而且可以顯著抑制CHO/APPBACE1和HEK293-APPsw細(xì)胞中Aβ_(42)的分泌。抗血管生成活性試驗(yàn)表明FMP-6-S2和FMP-6-H的硫酸化衍生物在體外可以抑制HMEC-1細(xì)胞的管腔形成。結(jié)論:從桑椹中提取分離得到6種均一多糖(FMP-2,FMP-5,FMP-6-H,FMP-6-S1,FMP-6-S2和FMP-6-S4),它們大多為酸性多糖(FMP-2為中性多糖),且大多數(shù)為果膠類多糖,但其結(jié)構(gòu)有差異。其中FMP-6-S1和FMP-6-S2都屬于RG-I型多糖,FMP-6-S4為RG-II型蛋白聚糖,但其各自分子量和單糖組成不同,導(dǎo)致它們的活性也不同。多糖FMP-6-S2及FMP-6-S2-01a可以促進(jìn)腸道優(yōu)勢菌群擬桿菌屬的細(xì)菌生長,可以發(fā)揮改善腸道菌群的作用,也可為以腸道菌群為靶點(diǎn),基于桑椹多糖調(diào)節(jié)腸道菌群的創(chuàng)新藥物研究奠定了理論基礎(chǔ)。FMP-6-H和FMP-6-S2的硫酸化衍生物均可明顯抑制HMEC-1細(xì)胞的管腔形成。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)證明,蛋白聚糖FMP-6-S4可以劑量依賴性地抑制穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APP和BACE1的CHO/APPBACE1細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染APPSwetish突變的HEK293-APPsw細(xì)胞中Aβ_(42)的生成,并且濃度依賴性地抑制Aβ_(42)聚集。因此,蛋白聚糖FMP-6-S4可以是治療阿爾茲海默癥的先導(dǎo)化合物,具有開發(fā)成為一種治療阿爾茲海默癥的創(chuàng)新藥物的潛力。綜上所述,桑椹多糖可能是桑椹中藥中治療便秘和抗衰老的活性物質(zhì)之一。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R284;R285
【圖文】：

圖 1-1 桑椹粗多糖提取流程2.2 粗多糖分離純化2.2.1 DEAE-Sepharose Fast Flow 分離桑椹酶聯(lián)水提粗多糖分離純化流程見圖 1-2。每次稱取 6 g 桑椹酶聯(lián)水提粗多糖（FMP），使其充分溶解于 100 mL 去離子水中。將其離心后，取上清液，上樣于 DEAE-Sepharose Fast Flow柱（50 cm × 5 cm）。用去離子水和不同離子強(qiáng)度（0.05、0.1、0.2 和 0.3 M）NaCl溶液依次進(jìn)行分布洗脫，采用自動部分收集器收集，根據(jù)硫酸苯酚法進(jìn)行檢測，繪制其洗脫曲線，將相同組分合并后，減壓濃縮至小體積，透析（分子截留量 3,500 Da）兩天后，減壓濃縮透析袋內(nèi)液后，冷凍干燥，依次得到組分 FMP-005，F(xiàn)MP-01，F(xiàn)MP-6-H 和 FMP-6（0.2 M NaCl 的洗脫液通過鹽析分離），F(xiàn)MP-03。2.2.2 Sephacryl HR-100 或 Sephacryl S-300 HR 柱純化桑椹粗多糖分離純化流程見圖 1-2。每次分別稱取 200 mg 經(jīng) DEAE-Sepharose Fast Flow 分離

圖 1-2 桑椹粗多糖分離純化流程2.3 桑椹多糖理化性質(zhì)的測定2.3.1 桑椹多糖分子量和純度多糖是一種多分散，結(jié)構(gòu)上具有微觀不均一性特點(diǎn)的復(fù)雜的生物大分子，其純度標(biāo)準(zhǔn)不能采用小分子化合物的純度標(biāo)準(zhǔn)來衡量。習(xí)慣上將均一多糖稱為“純”的多糖組分。均一多糖具有連續(xù)、正態(tài)分布的分子量和確定的糖組成和糖殘基連接方式。常見的多糖純度檢測方法有比旋度法、超離心法、高壓電泳法（如：聚丙酰胺凝膠電泳）和高效凝膠過濾色譜（HPGPC）。因操作比較省時、簡便和準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，使其HPGPC 法的應(yīng)用最為廣泛[70]。所以本課題采用 HPGPC 法測定桑椹多糖的純度及其分子量。本課題桑椹多糖純度測定條件如下：多糖凝膠色譜柱：將兩根 UltrahydrogelTM802 （8.0 mm × 300 mm，排阻極限 1.0

遵義醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文 李賽娟圖 1，附圖 2，附圖 3，附圖 4，附圖 5 和附圖 6），表明這 6 種多糖都為均一多糖，其分子量結(jié)果見表 1-4。3.2.2 多糖的中性糖含量根據(jù)硫酸-苯酚法測定中性糖含量，以葡萄糖的不同含量及其相對應(yīng)的吸光度值（OD490）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖 1-3，根據(jù)中性糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出多糖樣品的中性糖含量，其中均一多糖 FMP-2, FMP-5, FMP-6-H, FMP-6-S1, FMP-6-S2 和 FMP-6-S4的中性糖百分含量分別為 96.2%、32.6%、34.2%、91.8%、77.37%和 30%。結(jié)果見表1-4。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2765338