發(fā)布時(shí)間：2020-07-20 17:28

【摘要】：目的:以茜草科玉葉金花屬玉葉金花(Mussaenda Pubescens Ait.f.)的干燥根和莖為研究對(duì)象,對(duì)其中的化學(xué)成分進(jìn)行提取分離及鑒定,并對(duì)玉葉金花中4種化學(xué)成分的含量進(jìn)行測(cè)定,明確其在玉葉金花中的含量,并對(duì)其進(jìn)行體外抗炎活性進(jìn)行篩選。本課題為進(jìn)一步研究玉葉金花化學(xué)成分和生物活性篩選提供理論依據(jù),為明確其抗炎活性打下基礎(chǔ),對(duì)開展玉葉金花的開發(fā)利用具有重要的科學(xué)意義。方法:對(duì)玉葉金花粗粉乙醇回流提取3次,回收溶劑得乙醇總提取物,總提取依次用石油醚,乙酸乙酯萃取,回收溶劑。選擇玉葉金花乙酸乙酯部位和乙醇部位進(jìn)行進(jìn)一步分離,運(yùn)用硅膠色譜、ODS色譜、MCI色譜、大孔樹脂D101色譜,Sephadex LH-20色譜等分離純化方法對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行分離純化。對(duì)玉葉金花所得到的單體化合物利用HPLC對(duì)單體化合物純度驗(yàn)證,通過LC-MS、~1H-NMR、~(13)C-NMR、DEPT等波譜方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。運(yùn)用高效液相色譜儀對(duì)玉葉金花中綠原酸的含量測(cè)定,并通過一測(cè)多評(píng)的方法,以玉葉金花中綠原酸為內(nèi)標(biāo),對(duì)異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C三種成分的含量進(jìn)行測(cè)定,通過同時(shí)利用外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)測(cè)定不同產(chǎn)地中4種有機(jī)酸類化合物成分的含量,比較兩種方法的測(cè)定結(jié)果是否存在差異。通過用多脂多糖(LPS)誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞(RAW246.7)炎癥,利用噻唑藍(lán)(MTT)試劑法對(duì)一定濃度范圍內(nèi)綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C,4種化合物的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)定,并測(cè)定NO、IL-6、TNF-α的釋放量,從而探究4種成分的抗炎活性。結(jié)果:從玉葉金花醇提物的乙酸乙酯部位和乙醇部位提取分離得到15個(gè)化合物,鑒定了其中的14個(gè)化合物的結(jié)構(gòu),分別是山梔子苷甲酯(shanzhiside methyl ester)(1);schimoside(2),mussaendiside L(3),隱綠原酸甲酯(4-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(4),綠原酸甲酯(3-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(5),玉葉金花苷酸甲酯(mussaenoside)(6),異綠原酸B甲酯(3,4-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(7),異綠原酸A甲酯(3,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(8),異綠原酸C甲酯(4,5-dicaffeoylquinic acid methyl ester)(9),quinovic acid 3-O-β-D-glucopyranosyl-28-O-β-L-rhamnopyranosyl ester(10),綠原酸(3-dicaffeoylquinic acid)(11),異綠原酸B(3,4-dicaffeoylquinic acid)(12),異綠原酸A(3,5-dicaffeoylquinic acid)(13),異綠原酸C(4,5-dicaffeoylquinic acid)(14)。玉葉金花藥材中綠原酸在0.2547~2.5475μg(R~2=0.9999)具有良好的線性關(guān)系。以綠原酸作為內(nèi)參物,分別計(jì)算與異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C的相對(duì)校正因子,實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)。結(jié)果顯示一測(cè)多評(píng)和外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的相對(duì)校正因子重復(fù)性良好。測(cè)定綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C分別為0.1936~0.9680μg、0.2016-1.0080μg、0.1956-0.9780μg、0.2016-1.0080μg進(jìn)樣量范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,R~2均大于0.999。含量測(cè)定中方法學(xué)考察結(jié)果均符合相關(guān)要求。在20~100μM的給藥濃度范圍內(nèi),4種成分的細(xì)胞增殖與空白組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且抗炎活性存在一定的差異,其中綠原酸的抗炎效果不明顯,異綠原酸B的抗炎效果最好,綠原酸在給藥達(dá)到80μM時(shí)才具有一定的抗炎效果,而異綠原酸B在20μM時(shí)已具有一定的抗炎活性,當(dāng)給藥濃度達(dá)到80μM時(shí)已經(jīng)能夠完全抑制炎癥,在探究除綠原酸外其他三種化合的抗炎活性時(shí),給藥濃度為20~60μM時(shí),對(duì)IL-6的釋放有一定抑制效果,但是對(duì)TNF-α的釋放沒有抑制效果。結(jié)論:其中化合物2、4、5、7-14為首次從該植物中分離得到,玉葉金花中有機(jī)酸類成分含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單易行,重復(fù)性良好,一測(cè)多評(píng)方法應(yīng)用于玉葉金花中有機(jī)酸類成分的含量測(cè)定成本低且具有良好的重復(fù)性,為玉葉金花的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供科學(xué)參考。玉葉金花中咖啡�？鼘幩犷惢衔锞哂幸欢ǖ目寡谆钚�。
【學(xué)位授予單位】：廣西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5;R284.1
【圖文】：

綠原酸對(duì)照品 玉葉金花樣品圖 15：玉葉金花樣品及對(duì)照品 HPLC2.2.2 玉葉金花中綠原酸提取方法的考察（1）提取方法取玉葉金花莖粗粉（過 40 目篩）1.0g，精密稱定，精密量取 甲醇，稱重，分別用回流提取和超聲提取兩種方法提取，提取 30mi卻后補(bǔ)足失重，微孔濾膜濾過，按 2.1 項(xiàng)下色譜條件測(cè)定進(jìn)行分析。原酸的含量作為參考依據(jù)（n=2）時(shí)，結(jié)果為兩種提取方法測(cè)得綠原含量分別為，回流提取為 0.504 mg/g，超聲提取為 0.494 mg/g。通過表明，兩種提取方法對(duì)玉葉金花粉中綠原酸的提取無(wú)明顯差異，鑒

精密稱取玉葉金花粗粉（過 40 目篩）1.0 g，精密加入 50%甲醇 50 mL，稱定，超聲（300 W，45 kHz）處理 30 min，放冷，補(bǔ)足失重，微孔濾膜濾過，即為所得。③ 色譜條件色譜柱： SHISEIDO C18 MGⅡ（5μm，4.6 mml.D.×250 mm）；柱溫 30 ℃；流速：1.0 mL/min；流動(dòng)相：乙腈（A）：0.4%磷酸（B），梯度洗脫（0-20 min，10%A-18%A；20-50 min，18%B-20%B；50-55 min，20%B-34%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：325 nm[20]。在此色譜條件下，玉葉金花中 4種有機(jī)酸具有良好的分離效果，其中綠原酸理論塔板數(shù)為 41249，分離度R 為 2.0。色譜圖見圖 16。

圖 17 MTT 測(cè)定細(xì)胞毒性柱狀圖注：a 代表綠原酸；b 代表異綠原酸 A；c 代表異綠原酸 B；d 代表異綠原酸 C3.3.3 Griess 試劑測(cè)定 NO 的釋放表 47 和圖 18 表示為 4 種化合物不同給藥濃度下的 NO 釋放量及抑制效果。結(jié)果顯示，4 種化合物不同給藥濃度和誘導(dǎo)組與空白組相比，NO 釋放量顯著升高，給藥組與誘導(dǎo)組相比，隨著藥物濃度的增加，4 種化合物降低 NO 的釋放量作用越來(lái)越顯著。異綠原酸 B 在濃度為 80μM時(shí)表現(xiàn)出與空白組無(wú)差異，表明給藥濃度能夠達(dá)到完全抑制 LPS 的誘導(dǎo)作用。

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本文編號(hào)：2763734