【摘要】：研究背景及目的卵巢癌(ovarian cancer,OC)是女性常見的婦科惡性腫瘤之一,其致死率高居?jì)D科腫瘤之首,有確診時(shí)多為晚期的特點(diǎn),其中上皮性卵巢癌最常見。鉑類藥物是卵巢癌化療的首選藥物,有著重要的地位。而鉑類化療耐受或抵抗是卵巢癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的重要原因之一�？朔K類化療耐受或者抵抗的難題成為卵巢癌治療的重要環(huán)節(jié)。近些年針對(duì)鉑類化療耐受或抵抗問題,開展了單一非鉑類化療藥物和分子靶向藥物治療的研究,但疾病控制和延長(zhǎng)生存時(shí)間方面并不盡如人意。因此,尋找其他能夠提高鉑類療效的藥物或成為卵巢癌治療的重要方向。具有悠久歷史的中醫(yī)藥是一個(gè)巨大的寶庫(kù),在中國(guó)長(zhǎng)期的腫瘤防治醫(yī)療實(shí)踐中起到了重要的作用。很多中藥如在具有抗多種腫瘤作用的同時(shí),還對(duì)腫瘤化療起到減毒增敏的作用,改善化療相關(guān)癥狀,提高腫瘤患者生存質(zhì)量,延長(zhǎng)生存時(shí)間。中藥作為補(bǔ)充治療對(duì)提高患者耐受化療的能力和化療的效果有著積極的意義,因此結(jié)合醫(yī)學(xué)在惡性腫瘤的治療中具有一定的優(yōu)勢(shì)。中藥蟾皮功能清熱解毒、利水消腫,含有較多的活性成分,具有抗腫瘤、抗肝炎病毒等藥理活性,臨床用于治療原發(fā)性肝癌、肺癌、腸癌及慢性肝炎等疾病。在抗卵巢癌方面,我們發(fā)現(xiàn)具有較好的臨床療效,尤其對(duì)于復(fù)發(fā)耐藥性卵巢癌患者,可改善腫瘤晚期臨床癥狀,提高生存質(zhì)量,延長(zhǎng)生存時(shí)間。但有部分患者服用蟾皮有明顯的惡心、甚至嘔吐的胃腸道反應(yīng),常常不能耐受。另外,蟾皮這種來源于蟾蜍的藥材有小毒。蟾皮的毒性和胃腸道副反應(yīng)使其在抗卵巢癌口服治療中的使用受限制。因?yàn)轶钙さ幕钚猿煞謴?fù)雜,我們考慮若能進(jìn)行蟾皮有效成分抗卵巢癌作用方面的篩選研究,明確其在抗卵巢癌方面的優(yōu)效成分,減少其胃腸道反應(yīng),將大大提高其臨床使用的接受度、用藥安全性,使其更好的在臨床上應(yīng)用。并且,我們通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn),對(duì)蟾皮有效成分對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖活性抑制作用及機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步的探索,為今后中西結(jié)合臨床治療卵巢癌提供理論基礎(chǔ)。本研究分為以下四部分:1.蟾皮抑制卵巢癌細(xì)胞增殖有效成分的篩選;2.酯蟾毒配基對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響;3.酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)作用研究;4.酯蟾毒配基對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用及影響順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的機(jī)制研究。第一章蟾皮抑制卵巢癌細(xì)胞增殖有效成分的的篩選方法:5種蟾皮活性成分酯蟾毒配基、蟾毒靈、蟾毒它靈、華蟾酥毒基、蟾蜍噻嚀配置濃度梯度0.0064、0.032、0.16、0.8、4、20、100、500μM作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞72小時(shí),用In cell 2000 analyzer統(tǒng)計(jì)存活細(xì)胞數(shù)目,計(jì)算細(xì)胞存活率。篩選出抑制作用較強(qiáng)的2種成分,進(jìn)一步作用于人胸水來源的卵巢癌原代細(xì)胞72小時(shí),計(jì)算細(xì)胞存活率。結(jié)果:5種蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它靈有較好的抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞活性作用,在濃度高于20μM時(shí),有明顯的量-效關(guān)系;72小時(shí)測(cè)定并計(jì)算酯蟾毒配基IC50=48.62μM,蟾毒它靈IC50=86.86μM;其余脂溶性成分蟾毒靈、華蟾酥毒基和水溶性成分蟾蜍噻嚀抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖活性作用較弱。酯蟾毒配基和蟾毒它靈在濃度高于20μM時(shí),對(duì)人胸水來源的卵巢癌原代細(xì)胞抑制率均高于50%,能明顯抑制人胸水來源的卵巢癌原代細(xì)胞增殖。結(jié)論:蟾皮有效成分中脂溶性成分酯蟾毒配基和蟾毒它靈有較好的抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞和人胸水來源的卵巢癌原代細(xì)胞增殖,為5種蟾皮有效成分中抑制卵巢癌細(xì)胞增殖活性的優(yōu)勢(shì)成分。第二章酯蟾毒配基對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用及對(duì)順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響方法:酯蟾毒配基配置濃度梯度20、100、500μM單獨(dú)或與順鉑5μM聯(lián)合作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞24、48、72小時(shí),用MTS方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。流式細(xì)胞術(shù)和Hoechst熒光染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果:1、各濃度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞后,卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖活性降低。酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的作用,隨著酯蟾毒配基濃度增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。2、當(dāng)不同濃度酯蟾毒配基作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞72小時(shí)后,相對(duì)于空白對(duì)照組,酯蟾毒配基組的早期凋亡細(xì)胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)及死亡細(xì)胞(UL)比例均明顯增加,并且這種變化呈現(xiàn)出了劑量依賴性。3、酯蟾毒配基給藥處理后,隨著酯蟾毒配基濃度(20μM、100μM、500μM)的增加,凋亡小體增多。4、在不同濃度(20μM、100μM、500μM)酯蟾毒配基和5μM順鉑聯(lián)合作用72小時(shí)后,卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖活性發(fā)生不同的變化趨勢(shì)。20μM酯蟾毒配基與5μM順鉑聯(lián)用組的細(xì)胞增殖活性低于酯蟾毒配基20μM組(P0.001),高于順鉑組(P0.05);100μM酯蟾毒配基與5μM順鉑聯(lián)用組的細(xì)胞增殖活性低于酯蟾毒配基100μM組(P0.001),低于順鉑組(P0.01);500μM酯蟾毒配基與5μM順鉑聯(lián)用組的細(xì)胞增殖活性與酯蟾毒配基500μM組比較,無顯著性差異(P0.05),低于順鉑組(P0.001)。5、當(dāng)不同濃度酯蟾毒配基聯(lián)合順鉑作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞72小時(shí)后,相對(duì)于順鉑組,酯蟾毒配基20μM與順鉑聯(lián)用組的早期凋亡細(xì)胞比例(LR)比例明顯減少,晚期凋亡(UR)比例變化不明顯。酯蟾毒配基100μM與順鉑聯(lián)用組的早期凋亡細(xì)胞比例(LR)變化不明顯,晚期凋亡(UR)比例有所增加。酯蟾毒配基500μM與順鉑聯(lián)用組的早期凋亡細(xì)胞比例(LR)及晚期凋亡(UR)比例均明顯增加。6、當(dāng)不同濃度酯蟾毒配基聯(lián)合順鉑作用卵巢癌SKOV3細(xì)胞72小時(shí)后,Hoechst熒光染色法檢測(cè)到的凋亡變化情況同流式檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論:酯蟾毒配基能明顯抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖,具有明顯的濃度、時(shí)間依賴性。并能促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的凋亡。酯蟾毒配基20μM聯(lián)用順鉑,抑制卵巢癌細(xì)胞增殖活性的效果不及單用順鉑;酯蟾毒配基100μM聯(lián)用順鉑,抑制卵巢癌細(xì)胞增殖活性效果優(yōu)于單用順鉑和單用酯蟾毒配基。不同濃度的酯蟾毒配基和順鉑聯(lián)用后,對(duì)順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的作用可產(chǎn)生增強(qiáng)或減弱的影響。第三章酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)作用研究方法:卵巢癌細(xì)胞SKOV3注射于裸鼠皮下進(jìn)行移植瘤造模,造模成功后隨機(jī)分為8組,分別給予低、中、高濃度酯蟾毒配基,低、中、高濃度酯蟾毒配基與順鉑合用進(jìn)行干預(yù),設(shè)置空白對(duì)照組和順鉑組,腹腔注射給藥,酯蟾毒配基隔日1次,順鉑每周1次,比較各組裸鼠移植瘤體積、瘤重。結(jié)果:各組給藥后裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)均受到抑制。酯蟾毒配基低、中、高劑量組各組間抑瘤率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),抑瘤率由低到高依次為酯蟾毒配基低劑量組(L)酯蟾毒配基中劑量組(M)酯蟾毒配基高劑量組(H),順鉑組(PT)、酯蟾毒配基低、中、高劑量和順鉑合用組四組間抑瘤率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),抑瘤率由低到高依次為L(zhǎng)+PTPTM+PTH+PT。結(jié)論:酯蟾毒配基能抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng),低劑量酯蟾毒配基對(duì)順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)有拮抗減效作用,中、高劑量酯蟾毒配基對(duì)順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)有協(xié)同增效作用。第四章機(jī)制研究方法:選擇Affymetrix Prime View TMHuman Gene Expression Array表達(dá)譜芯片,用基因芯片篩查技術(shù)分析卵巢癌細(xì)胞SKOV3在接受酯蟾毒配基作用、酯蟾毒配基與順鉑聯(lián)合作用處理后基因表達(dá)的變化,利用生物信息學(xué)分析差異基因,通過表達(dá)模式聚類分析、GO富集分析、KEGG富集分析,尋找有顯著差異變化信號(hào)通路及關(guān)鍵分子,通過PCR、Western Blot方法檢測(cè)關(guān)鍵基因的蛋白表達(dá)進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證。結(jié)果:1、酯蟾毒配基可能通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT/CREB通路,促進(jìn)凋亡,抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖,是酯蟾毒配基影響順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的作用的關(guān)鍵所在。2、PCR結(jié)果顯示酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞后,AKT1不表達(dá);與空白對(duì)照組比較,酯蟾毒配基20μM組中CREB1水平無明顯差異(P0.05),酯蟾毒配基100μM組中CREB1水平明顯增加(P0.05)。與順鉑5μM組比較,酯蟾毒配基20μM+順鉑5μM組中CREB1水平無明顯差異(P0.05),酯蟾毒配基100μM+順鉑5μM組中CREB1水平明顯增加(P0.05)。3、Western Blot結(jié)果顯示,酯蟾毒配基作用于卵巢癌SKOV3細(xì)胞后,與空白對(duì)照組比較,酯蟾毒配基20μM組、酯蟾毒配基100μM組中AKT水平均降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平均增高。與順鉑5μM組比較,酯蟾毒配基20μM+順鉑5μM組中AKT水平增高、Caspase3水平降低,磷酸化CREB水平降低;酯蟾毒配基100μM+順鉑5μM組中AKT水平降低、Caspase3水平增高,磷酸化CREB水平增高。結(jié)論:1、酯蟾毒配基通過PI3K/AKT/CREB通路,上調(diào)Caspase3水平,促進(jìn)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡,可能是酯蟾毒配基抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的機(jī)制。2、CREB可能是卵巢癌SKOV3細(xì)胞的抑癌轉(zhuǎn)錄因子。3、不同濃度的酯蟾毒配基和順鉑聯(lián)用后,可能通過PI3K/AKT/CREB通路,調(diào)節(jié)Caspase3水平,通過凋亡途徑對(duì)順鉑抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的作用產(chǎn)生協(xié)同或拮抗影響。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

海軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文表 5 酯蟾毒配基作用后 SKOV3 細(xì)胞的存活率（%）（ s）時(shí)間（h）濃度（μM）24 48 722095.5±13.2 92.1±6.0 73.7±12.710044.3±3.5 34.2±4.9 23.2±8.750040.5±2.8 18.2±1.5 13.2±1.3

酯蟾毒配基對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用

作用卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞 72 小時(shí)后，相對(duì)于空白對(duì)照組，酯蟾毒配基組的早期凋比例（LR）及晚期凋亡（UR）及死亡細(xì)胞（UL）比例均明顯增加，并щ這種變出了劑量依賴性�？瞻讓�(duì)照 酯蟾毒配基 20μM酯蟾毒配基 100μM 酯蟾毒配基 500μM

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2761764