【摘要】：目的:本研究擬采用代謝組學的方法,在明確與脾虛相關的差異代謝物基礎上,研究麩炒前后的蒼術對脾虛大鼠血清和尿液差異代謝物組成和水平的不同調(diào)節(jié)作用,明確蒼術麩炒后健脾作用增強的作用機理和潛在生物標志物水平差異;并通過對麩炒前后的蒼術中主要成分進行藥代動力學和排泄動力學方面的研究,明確其異同,從主要成分體內(nèi)代謝消除的角度解釋蒼術麩炒后的增效作用;通過代謝組學以及結(jié)合藥代動力學和排泄動力學的研究,進而闡釋蒼術炮制機理。材料與方法:1.材料蒼術購于北京同仁堂藥房沈陽分店,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學鑒定教研室李峰教授鑒定為茅蒼術Atractylodes Lancea(Thunb.)DC.的干燥根莖,蒼術麩炒方法參考《中國藥典》(2015年版)飲片的炮制方法。番瀉葉購于成大方圓連鎖藥店沈陽店。嗎丁啉購于西安楊森制藥有限公司。參苓白術散購于山西華康藥業(yè)股份有限公司。ELISA試劑盒購于上海聯(lián)碩生物科技有限公司。TRIzol購于德州曼巴商貿(mào)有限公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于Takara公司。分析甲醇、乙腈均購于德國Merck公司。甲酸購于上海CNW公司。白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ、蒼術苷A和對乙酰氨基酚均購于江蘇永健醫(yī)療科技有限公司,純度均大于98%。2.方法2.1蒼術麩炒前后干預脾虛大鼠的藥效學研究SPF級SD大鼠120只,隨機分10組(n=12)即:空白對照組、模型組、參苓白術散組、嗎丁啉組、麩炒蒼術高劑量組(麩炒高組)、麩炒蒼術中劑量組(麩炒中組)、麩炒蒼術低劑量組(麩炒低組)、生蒼術高劑量組(生高組)、生蒼術中劑量組(生中組)和生蒼術低劑量組(生低組)。模型組大鼠采用飲食不節(jié)、疲勞過度及苦寒瀉下復合法造成大鼠脾虛模型。將生蒼術及麩炒蒼術分別制備成高、中、低3個濃度的溶液,共給藥10 d。采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)方法測定大鼠血清中與消化酶活力變化有關的胰蛋白酶和淀粉酶的含量、與胃腸激素水平有關的血管活性腸肽、生長抑素、胃泌素和P物質(zhì)的含量、與膜蛋白功能有關的NA~+-K~+-ATP酶的含量、與線粒體酶活力有關的琥珀酸脫氫酶的含量。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法測定大鼠小腸中與胃腸激素水平有關的血管活性腸肽、生長抑素、胃泌素和P物質(zhì)的相對表達量。2.2蒼術麩炒前后干預脾虛大鼠的代謝組學研究收集上述空白對照組(n=10)、模型組(n=10)、生蒼術組(n=10)和麩炒蒼術組(n=10)的血清和尿液,采用UPLC-Q/TOF-MS進樣分析。先將色譜條件優(yōu)化,確定離子源類型,利用MassLynx 4.1軟件進行色譜峰識別以及峰匹配,然后將積分數(shù)據(jù)進行歸一化后應用SIMCA_P軟件進行多維統(tǒng)計分析。采用無監(jiān)督模式識別(主成分分析PCA)及有監(jiān)督模式識別(偏最小二乘-判別分析PLS-DA、正交偏最小二乘-判別分析OPLS-DA)進行分析,利用得分圖、OPLS-DA載荷圖、VIP值(VIP1)找到差異變量,再用t-test對篩選的差異變量進行驗證,只有p值小于0.05的差異變量才被認為是差異代謝物。以這些差異變量為依據(jù),結(jié)合參考文獻以及METLIN、HMDB和KEGG等數(shù)據(jù)庫信息,進行差異代謝物的鑒定。先鑒定出空白對照組與模型組之間的差異代謝物,并根據(jù)這些差異代謝物進行代謝通路歸屬分析,再鑒定出經(jīng)生蒼術及麩炒蒼術分別干預后所調(diào)節(jié)的潛在生物標志物,并根據(jù)這些潛在生物標志物進行代謝通路歸屬分析。2.3蒼術麩炒前后主要成分的藥代動力學研究將大鼠隨機分為生蒼術組(n=6)和麩炒蒼術組(n=6)。大鼠灌胃給予生蒼術和麩炒蒼術提取物后,分別于給藥后0.083、0.016、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h進行眼眶取血,制備血漿樣品,用甲醇沉蛋白后進行分析,以對乙酰氨基酚為內(nèi)標。采用UPLC-MS/MS檢測技術,以0.1%甲酸水-乙腈溶液作為流動相梯度洗脫,流速0.3 mL/min,色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C_(18)(1.7μm,2.1×100 mm),柱溫40℃,電噴霧離子源(ESI~+),多反應監(jiān)測(MRM)模式進行檢測。給大鼠分別灌胃生蒼術和麩炒蒼術提取物,采用上述方法檢測大鼠血漿中白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ和蒼術苷A的血藥濃度。數(shù)據(jù)經(jīng)DAS3.2.8軟件處理,計算血漿中主要成分的藥代動力學參數(shù)(達峰時間、達峰濃度、半衰期等),繪制藥時曲線。2.4蒼術麩炒前后主要成分的排泄動力學研究大鼠隨機分為生蒼術組(n=6)和麩炒蒼術組(n=6)。大鼠灌胃給予生蒼術和麩炒蒼術提取物后,分別于給藥后0、3、6、9、12、24、36、48、60、72 h收集大鼠尿液,制備尿液樣品,用甲醇沉蛋白后進行分析,以對乙酰氨基酚為內(nèi)標。采用UPLC-MS/MS檢測技術,以0.1%甲酸水-乙腈溶液作為流動相梯度洗脫,流速0.3 mL/min,色譜柱Waters ACQUITY UPLC BEH C_(18)(1.7μm,2.1×100 mm),柱溫40℃,電噴霧離子源(ESI~+),多反應監(jiān)測(MRM)模式進行檢測。給大鼠分別灌胃生蒼術和麩炒蒼術提取物,采用上述方法檢測大鼠尿液中白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ和蒼術苷A的濃度。數(shù)據(jù)經(jīng)DAS3.2.8軟件處理,測定其尿藥濃度經(jīng)時過程,根據(jù)排泄量-時間數(shù)據(jù)計算排泄動力學參數(shù),繪制累計排泄-時間曲線。結(jié)果:1.蒼術麩炒前后干預脾虛大鼠的藥效學研究結(jié)果與空白對照組相比較,模型組胰蛋白酶、淀粉酶、血管活性腸肽、生長抑素、胃泌素、P物質(zhì)、NA~+-K~+-ATP酶和琥珀酸脫氫酶的含量均顯著降低(p0.05),各給藥組均可使上述各指標的含量顯著升高(p0.05)。經(jīng)進一步對同等劑量的生蒼術和麩炒蒼術進行比較,發(fā)現(xiàn)麩炒蒼術較生蒼術使上述指標的含量升高更明顯。與空白對照組相比較,模型組血管活性腸肽、生長抑素、胃泌素和P物質(zhì)的相對表達量均顯著降低(p0.05),各給藥組均可使上述各指標的相對表達量顯著升高(p0.05)。經(jīng)進一步對同等劑量的生蒼術和麩炒蒼術進行比較,發(fā)現(xiàn)麩炒蒼術較生蒼術使上述指標的相對表達量升高更明顯。2.蒼術麩炒前后干預脾虛大鼠的代謝組學研究結(jié)果所構建的PLS-DA模型中空白對照組和模型組基本能夠很好的分開,各給藥組與模型組區(qū)分開且靠近空白對照組,說明各給藥組的代謝物特征與模型組具有明顯差異。與空白對照組相比,從模型組血清中發(fā)現(xiàn)D-尿膽素原等7個物質(zhì)的水平均顯著升高(p0.05),而L-酪氨酸等7個物質(zhì)的水平均顯著降低(p0.05)。推測這些物質(zhì)是與脾虛相關的差異代謝物,經(jīng)對差異代謝物分析發(fā)現(xiàn)這14個化合物分別與10條代謝通路有關。在明確與脾虛相關的差異代謝物和代謝通路的基礎上,對生蒼術和麩炒蒼術分別干預后的大鼠血清進行研究。生蒼術和麩炒蒼術均可對部分潛在生物標志物具有調(diào)節(jié)作用,但只在肌苷三磷酸和白三烯C_4的調(diào)節(jié)作用上,生蒼術要優(yōu)于麩炒蒼術。在膽紅素、S-腺苷高半胱氨酸、酪胺、磷酸膽堿和S-腺苷甲硫氨酸的調(diào)節(jié)作用上,麩炒蒼術要優(yōu)于生蒼術,從血清代謝組學角度解釋了麩炒蒼術藥效優(yōu)于生蒼術的機理。所構建的PLS-DA模型中空白對照組和模型組基本能夠很好的分開,各給藥組與模型組區(qū)分開且靠近空白對照組,說明各給藥組的代謝物特征與模型組具有明顯差異。與空白對照組相比,從模型組尿液中發(fā)現(xiàn)L-脯氨酸等10個物質(zhì)的水平均顯著升高(p0.05);而半胱氨酸等16個物質(zhì)的水平均顯著降低(p0.05)。推測這些物質(zhì)是與脾虛相關的差異代謝物,經(jīng)對差異代謝物分析發(fā)現(xiàn)這26個化合物分別與16條代謝通路有關。在明確與脾虛相關的差異代謝物和代謝通路的基礎上,對生蒼術和麩炒蒼術分別干預后的大鼠尿液進行研究。生蒼術和麩炒蒼術均可對部分潛在生物標志物具有調(diào)節(jié)作用,但只在胞磷膽堿和半胱氨酸的調(diào)節(jié)作用上,生蒼術要優(yōu)于麩炒蒼術。在L-巖藻糖-1-磷酸鹽、精氨基琥珀酸和L-胱氨酸的調(diào)節(jié)作用上,麩炒蒼術要優(yōu)于生蒼術,從尿液代謝組學角度解釋了麩炒蒼術藥效優(yōu)于生蒼術的機理。3.蒼術麩炒前后主要成分的藥代動力學研究結(jié)果白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ和蒼術苷A在測定濃度范圍內(nèi)線性關系良好(R~2≥0.9919),精密度和準確度均在±15%內(nèi),符合《中國藥典》(2015年版)收載的生物樣品定量分析方法驗證指導原則的要求。說明本法專屬性強、靈敏度高、精密度好,可用于大鼠灌胃生蒼術和麩炒蒼術提取物后血漿中白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ和蒼術苷A的藥代動力學研究。和生蒼術組相比,麩炒蒼術組中白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ和蒼術苷A的C_(max)均顯著升高(p0.05);麩炒蒼術組中白術內(nèi)酯Ⅲ的t_((1/2))顯著縮短(p0.05);麩炒蒼術組中白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ和白術內(nèi)酯Ⅲ的AUC_((0-t))均顯著增加(p0.05)。藥代動力學參數(shù)結(jié)果表明麩炒蒼術血漿中4種成分吸收效果優(yōu)于生蒼術。4.蒼術麩炒前后主要成分的排泄動力學研究結(jié)果白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ和蒼術苷A在測定濃度范圍內(nèi)線性關系良好(R~2≥0.9949),精密度和準確度均在±15%內(nèi),符合《中國藥典》(2015年版)收載的生物樣品定量分析方法驗證指導原則的要求。說明本法專屬性強、靈敏度高、精密度好,可用于大鼠灌胃生蒼術和麩炒蒼術提取物后尿液中白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ和蒼術苷A的排泄動力學研究。和生蒼術組相比,麩炒蒼術組中白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ和蒼術苷A的尿排總量均顯著升高(p0.05);麩炒蒼術組中白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ和蒼術苷A的總尿排率均顯著升高(p0.05)。排泄動力學參數(shù)結(jié)果顯示麩炒蒼術尿液中4種成分排泄率高于生蒼術。結(jié)論:1.生蒼術和麩炒蒼術對脾虛大鼠均有治療作用,且麩炒蒼術健脾作用優(yōu)于生蒼術。蒼術麩炒后健脾作用增強可歸因于對消化吸收功能中消化酶活力的調(diào)節(jié)能力及胃腸激素水平的調(diào)節(jié)能力增強;以及對細胞膜結(jié)構和功能中膜蛋白的調(diào)節(jié)能力及物質(zhì)能量代謝中線粒體酶活性的調(diào)節(jié)能力增強。2.L-酪氨酸、D-尿膽素原、膽紅素等物質(zhì)可能為與脾虛相關的差異代謝物,氨酰-tRNA生物合成、丙氨酸,天門冬氨酸和谷氨酸代謝、酪氨酸代謝等通路可能為與脾虛相關的代謝通路。生蒼術和麩炒蒼術對脾虛大鼠潛在生物標志物均具有調(diào)節(jié)作用,但麩炒蒼術對潛在生物標志物的調(diào)節(jié)作用要優(yōu)于生蒼術。3.明確了麩炒可促進蒼術中主要成分白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ和蒼術苷A的吸收。4.明確了麩炒可促進蒼術中主要成分白術內(nèi)酯Ⅰ、白術內(nèi)酯Ⅱ、白術內(nèi)酯Ⅲ和蒼術苷A的排泄。綜合以上結(jié)論,本文分別從代謝組學、藥代動力學及排泄動力學角度闡明了蒼術炮制機理。
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R283
【圖文】：

各組大鼠血清中TRY的含量（ng/mL）

各組大鼠血清中AMS的含量（μmoL/L）

各組大鼠血清中VIP的含量（pg/mL）

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本文編號：2761642