發(fā)布時間：2020-07-18 19:42

【摘要】：研究目的:本實驗主要通過建立大鼠濕疹模型,來研究金雀涼血解毒顆粒對濕疹大鼠炎癥以及免疫相關(guān)指標(biāo)的影響,逐步探討金雀涼血解毒顆粒的相關(guān)作用機制。為本方今后在臨床上的推廣和使用提供有力的理論及實驗依據(jù),為明確本方具體的作用路徑及靶點提供理論支撐。研究方法:隨機將60只大鼠分成6組,每組各10只,依次為空白組、模型組、復(fù)方甘草酸苷組、金雀涼血解毒顆粒高劑量組、中劑量組、低劑量組。除去空白組10只大鼠外,其余各組大鼠利用7%二硝基氯苯(DCNB)溶液涂擦大鼠背部建立濕疹模型。濕疹模型完成后稱重,按體重開始給藥10天(給藥計算方法:按照體表面積換算法,將人每天給藥劑量換算成大鼠即為4g/kg,人的臨床給藥劑量為中劑量組,高劑量給藥濃度增加一倍,低劑量給藥劑量減少一倍),最后一次給藥后12h禁食不禁水,稱重后處死取材,腹主動脈取血,摘取脾臟、胸腺、剪取造模處皮膚。脾臟、胸腺直接稱重計算臟器指數(shù),皮膚組織每組取三個用甲醛固定做病理切片,其余取完直接液氮冷凍后放入-80℃冰箱備用。腹主動脈取血,肝素鈉抗凝,靜置大約1小時后離心(2000轉(zhuǎn)15分鐘),取上層血清儲存于-80℃冰箱,以備后續(xù)實驗。采用HE染色觀察大鼠局部濕疹皮損組織病理學(xué)變化;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中炎癥細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-1β、IFN-γ、TNF-α含量,體液免疫中IgA、IgG、IgM免疫球蛋白含量,補體免疫因子C3、C4的影響;采用Western blot法檢測濕疹皮損組織中P-P38和NF-κB65的蛋白表達(dá)水平;采用Real time PCR法檢測濕疹皮疹組織中TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)水平。并對各項指標(biāo)的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計,應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。研究結(jié)果:1、大鼠濕疹實驗動物模型復(fù)制成功。利用DNCB誘導(dǎo)的大鼠濕疹模型,使大鼠背部皮損出現(xiàn)紅斑、丘疹、滲液、結(jié)痂等濕疹樣改變,造模后大鼠出現(xiàn)不停搔抓、翻滾等行為,符合實驗動物學(xué)濕疹造模成功表現(xiàn)。與空白組比較,模型組皮損評分具有臨床統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。皮損評分平均值2.62(總分3分),大鼠濕疹模型建立成功。2、HE染色結(jié)果提示:空白組大鼠,表皮層、真皮層結(jié)構(gòu)完好,層次分明,厚度正常。模型組大鼠,皮膚角化過度、角化不全、顆粒層肥厚、棘層肥厚、真皮水腫,內(nèi)可見少量巨噬細(xì)胞及嗜中性粒細(xì)胞浸潤。皮膚病理所見符合濕疹皮損表現(xiàn),證明濕疹模型大鼠建立成功。給藥10天后處死取材,病理組織發(fā)現(xiàn),高、中、低劑量金雀涼血給藥組和復(fù)方甘草酸苷組都能抑制皮損角化過度、角化不全、顆粒層肥厚、棘層肥厚的病理改變。與模型組比較,具有顯著性差異。3、ELISA結(jié)果顯示:與空白組相比,濕疹大鼠模型組血清中IL-2與IFN-γ的表達(dá)降低(P0.05),而IL-4、TNF-α IL-1β的表達(dá)升高(P0.05);經(jīng)各劑量金雀涼血解毒顆粒及復(fù)方甘草酸苷治療后,IL-2與IFN-y的含量均有所升高,IL-4、TNF-α、IL-1β的含量均有所降低,與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),且中劑量金雀涼血解毒顆粒給藥組效果優(yōu)于復(fù)方甘草酸苷組。結(jié)果說明:中劑量金雀涼血解毒顆粒組(臨床劑量)可有效升高IL-2與IFN-y的含量、降低IL-4、TNF-α、IL-1β的含量,作用優(yōu)于復(fù)方甘草酸苷對照組。4、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)結(jié)果顯示:與空白組相比,濕疹模型大鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均降低(P0.05),提示濕疹大鼠免疫功能降低;經(jīng)各劑量金雀涼血解毒顆粒及復(fù)方甘草酸苷對照組給藥后,各組脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有不同程度增高。其中,復(fù)方甘草酸苷組及中劑量金雀涼血解毒顆粒組脾臟指數(shù)顯著增高,復(fù)方甘草酸苷組及高、中劑量金雀涼血解毒顆粒組胸腺指數(shù)明顯升高,與模型組相比,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)果說明:中劑量金雀涼血解毒顆粒組能顯著提高濕疹模型降低的脾臟指數(shù),高、中劑量金雀涼血解毒顆粒組能顯著增高濕疹模型降低的胸腺指數(shù),改善濕疹大鼠免疫器官功能,其作用優(yōu)于復(fù)方甘草酸苷對照組。5、IgA、IgM、IgG檢測結(jié)果顯示:與空白組比較,實驗鼠造模后血清中IgA、IgM、IgG含量均顯著升高,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),提示濕疹大鼠體液免疫功能失衡;經(jīng)中劑量金雀涼血解毒顆粒治療后,血清中IgA、IgM、IgG含量均顯著降低,與模型組比較有明顯差異(P0.05),且中劑量作用優(yōu)于復(fù)方甘草酸苷組。結(jié)果說明:中劑量金雀涼血解毒顆粒能降低濕疹模型大鼠體液免疫中免疫球蛋白IgA、IgM、IgG含量,其調(diào)節(jié)體液免疫的作用優(yōu)于復(fù)方甘草酸苷組。6、C3、C4檢測結(jié)果顯示:與空白組比較,實驗鼠造模后血清中C3、C4含量均明顯增多,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),提示濕疹大鼠免疫功能失衡;經(jīng)中劑量金雀涼血解毒顆粒治療后,血清中C3、C4含量均明顯減少,與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),且效果優(yōu)于復(fù)方甘草酸苷對照組。結(jié)果說明:中劑量金雀涼血解毒顆粒可以有效降低大鼠濕疹模型血清中升高的補體免疫因子C3、C4的含量,調(diào)節(jié)免疫失衡,作用優(yōu)于復(fù)方甘草酸苷組。7、Western Blot和Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:與空白組比較,模型組大鼠皮損組織中P-P38和NF-KB65蛋白和TNF-α和IL-1β基因表達(dá)均明顯升高(P0.01);經(jīng)各劑量金雀涼血解毒顆粒及復(fù)方甘草酸苷治療后,皮損組織中P-P38和NF-KB65的蛋白和TNF-α和IL-1β基因表達(dá)均顯著降低,與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01),其中,復(fù)方甘草酸苷對照組效果優(yōu)于各劑量金雀涼血解毒顆粒組。結(jié)果說明:各劑量金雀涼血解毒顆粒組以及復(fù)方甘草酸苷對照組都能有效降低P-P38和NF-KB65蛋白和TNF-α和IL-1 β3基因表達(dá)。結(jié)論:1、金雀涼血解毒顆�？捎行Ц纳拼笫鬂裾钅Ｐ脱装Y情況,降低皮損評分,有效控制病情發(fā)展。2、金雀涼血解毒顆粒可有效升高大鼠濕疹模型IL-2與IFN-y的含量、降低IL-4、TNF-α、IL-1β的含量,從而起到抑制濕疹炎癥表達(dá)的作用。3、金雀涼血解毒顆�？捎行д{(diào)節(jié)大鼠免疫球蛋白IgA、IgM、IgG,補體免疫因子C3、C4,胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)等各項免疫指標(biāo)的異常,證實本方的作用機制與調(diào)節(jié)大鼠免疫功能有關(guān)。4、金雀涼血解毒顆�？梢砸种芇38MAPK/NF-KB通路上相關(guān)因子P-P38和NF-KB65的蛋白水平和TNF-α和IL-1β基因表達(dá)水平從而下調(diào)了相關(guān)炎癥因子,提示了金雀涼血解毒顆粒可能通過抑制P38MAPK/NF-KB通路的活化,從而減輕大鼠濕疹模型的炎癥反應(yīng)并調(diào)節(jié)其免疫功能。
【學(xué)位授予單位】：黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文逡逑圖１：邐、邋＿邐１邐？逡逑１１１．邋，邋Ｍ逡逑ＡＢＣ逡逑＾邋｜ｌ邋１邋＇Ｉ邋１邐１逡逑—Ｌ－“上」逡逑Ｄ邐Ｅ邐Ｆ逡逑圖１：邋Ａ為陰性對照空白組；Ｂ－Ｆ為隨機分為的５組濕疹模型組。逡逑邐表１皮損評分表邐邐逡逑組別邐？邐平均得分邐Ｔｊ｜邐Ｐ邐逡逑Ａ邋組邐１０邐０邐０＿０８逡逑Ｂ邋組邐１０邐２＿７３邐０．１３邐０．０２７＊逡逑Ｃ邋組邐１０邐２．５８邐０．１２邐０．０１５＊逡逑Ｄ邋組邐１０邐２．６１邐０．１９邐０．０３１＊逡逑Ｅ邋組邐１０邐２．６０邐０．０９邐０．０１７＊逡逑Ｆ邋組邐１＿０邐２＾５９邐０￡２邐０．０２６＊逡逑圖１和表１為皮損評分?jǐn)?shù)據(jù)采用ＳＰＳＳ邋２２．０統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，計量逡逑資料以ｘ±ｓ表不，進(jìn)行ｔ檢驗。以Ｐ＜０．０５為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Ｂ、Ｃ、Ｄ、逡逑Ｅ、Ｆ組分別與Ａ組評分相比，均具有臨床統(tǒng)計學(xué)意義，＊Ｐ＜０．０５。逡逑２．實驗分析與討論逡逑成功的濕疹大鼠動物模型的建立是后期進(jìn)行實驗研宄觀察的基礎(chǔ)，因逡逑此，在筆者在實驗思路設(shè)計階段查閱了大量濕疹相關(guān)研宄的文獻(xiàn)

ＣＧ２邐２４５．５邐ｎｇ／＾ｉｌ邐１．９９邐１．８逡逑ＣＧ３邐２２４邐ｎｇ／ｆｉｌ邐２．０５邐１．８９逡逑ｉｇｈ－ＪＱＬＸｌ邐３７５．５邐ｎｇ／＾ｌ邐２．０２邐１．９２逡逑ｉｇｈ－ＪＱＬＸ２邐３３８．１邐ｎｇ／ｊｉｌ邐１．９３邐１．８逡逑ｉｇｈ－ＪＱＬＸ３邐２２３．７邐ｎｇ／＾１邐２．０１邐１．８１逡逑ｅｄｉｕｍ－ＪＱＬＸＩ邐２８５．９邐ｎｇ／＾ｌ邐１．９５邐１．８逡逑ｅｄｉｕｍ－ＪＱＬＸ２邐３６１．４邐ｎｇ／＾ｌ邐２邐１．８４逡逑ｅｄｉｕｍ－ＪＱＬＸ３邐２０２．４邐ｎｇ／ｊｉｌ邐２．０３邐１．８３逡逑ｏｗ－ＪＱＬＸｌ邐２３２．１邐ｎｇ／｜ｉｌ邐１．９９邐１．８６逡逑ｏｗ－ＪＱＬＸ２邐２２１邐ｎｇ／＾ｘｌ邐２．０３邐Ｉ邋．８２逡逑ｏｗ－ＪＱＬＸ３邐１邋１３．３邐ｎｇ／＾１邐２．０６邐１．８６逡逑ＲＮＡ電泳＊逡逑１邐２邐３邋４邐５邋６邋７邐８邋９邋１０邋１１邋１２邋１３邋１４邋１５邋１６邋１７邋１８－＇逡逑

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【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2761344