【摘要】：目的:臭椿苦酮是從傳統(tǒng)中國藥用植物臭椿中提取的苦木素類天然小分子化合物,臭椿苦酮已被證實(shí)具有抗腫瘤、抗艾滋、抗瘧疾、抗過敏、消炎等多種活性。但是臭椿苦酮對人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞株的抗增殖作用及其潛在機(jī)制尚未見報(bào)道。在本研究中,我們通過細(xì)胞分子生物學(xué)手段進(jìn)行實(shí)驗(yàn),目的是討論臭椿苦酮在體外對HL-60細(xì)胞株的增殖抑制作用及其機(jī)制。方法:在體外通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測臭椿苦酮對HL-60細(xì)胞株生存活力的影響。通過Annexin V-APC/7-ADD染色細(xì)胞,運(yùn)用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡比例。通過碘化丙啶(PI)染色細(xì)胞,運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期變化。通過吖啶橙(AO)染色,在電子顯微鏡下觀察臭椿苦酮能否誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。通過蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(WB)檢測自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過添加自噬抑制劑,討論臭椿苦酮誘導(dǎo)的自噬現(xiàn)象在其抑制HL-60細(xì)胞增殖過程中扮演的角色。結(jié)果:MTT實(shí)驗(yàn)顯示臭椿苦酮對HL-60細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,并且對細(xì)胞的增殖抑制作用呈現(xiàn)濃度-時(shí)間依賴性,24、48、72小時(shí)半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為12.18、8.497、5.986μmol/L。Annexin V-APC/7-ADD染色試驗(yàn)顯示臭椿苦酮可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡,并且凋亡細(xì)胞數(shù)量呈濃度依賴性,5、10、20μmol/L臭椿苦酮作用48小時(shí)后,各組細(xì)胞凋亡率分別為42.02±0.54,52.05±2.27,59.69±0.25%;PI染色顯示臭椿苦酮可通過上調(diào)G0/G1期細(xì)胞的百分比使HL-60細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯,各組G0/G1期細(xì)胞比例分別為53.54±0.88,58.42±0.31和65.57±3.16%。AO染色提示臭椿苦酮可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中酸性自噬囊泡的形成,提示臭椿苦酮可誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生自噬,運(yùn)用BaF-A1預(yù)處理可以顯著減弱這個(gè)過程。WB實(shí)驗(yàn)顯示臭椿苦酮以劑量依賴的方式上調(diào)了HL-60細(xì)胞中beclin-1和LC3-II蛋白并下調(diào)了LC3-I和p62蛋白的表達(dá)水平。通過MTT實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)胞活力測定和Annexin V-APC/7-ADD染色進(jìn)行細(xì)胞凋亡測定,運(yùn)用BaF-A1預(yù)處理的方式進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)臭椿苦酮對HL-60細(xì)胞的抗增殖作用可能部分歸因于誘導(dǎo)自噬介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)論:臭椿苦酮對人早幼粒白血病HL-60細(xì)胞具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,可能與其能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡、周期阻滯和自噬有關(guān)。臭椿苦酮可能通過促進(jìn)自噬核心蛋白beclin-1的表達(dá),抑制p62蛋白表達(dá),并且促進(jìn)LC3-I蛋白向LC3-II蛋白轉(zhuǎn)化來誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生自噬性細(xì)胞凋亡。
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285
【圖文】：

結(jié) 果1 臭椿苦酮抑制HL-60細(xì)胞增殖1.1 臭椿苦酮結(jié)構(gòu)式（圖1.A）。1.2 MTT 實(shí)驗(yàn)用于評估臭椿苦酮的細(xì)胞毒性對 HL-60 細(xì)胞株增殖的影響；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在體外實(shí)驗(yàn)中，臭椿苦酮可明顯抑制人早幼粒白血病 HL-60 細(xì)胞株的增殖，并且細(xì)胞相對活力呈現(xiàn)濃度及作用時(shí)間依賴趨勢，細(xì)胞相對活力與臭椿苦酮濃度及作用時(shí)間均呈反比，隨著濃度增加和作用時(shí)間延長，細(xì)胞增殖活性降低（圖 1.B）；本實(shí)驗(yàn)中，臭椿苦酮作用于 HL-60 細(xì)胞 24、48、72h 的 IC50 值分別為 12.18、8.497、5.986μM。圖 1 臭椿苦酮抑制 HL-60 細(xì)胞增殖（A.臭椿苦酮結(jié)構(gòu)式；B.臭椿苦酮抑制人早幼粒白血病 HL-60 細(xì)胞株增殖，細(xì)胞相對活力呈現(xiàn)濃度及作用時(shí)間依賴趨勢）2 臭椿苦酮誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡Annexin V-APC/7-ADD 雙染實(shí)驗(yàn)用于評估臭椿苦酮對 HL-60 細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡的作用，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，臭椿苦酮處理的 HL-60 細(xì)胞凋亡比例明顯上升（圖2.A）。在 37℃恒溫下用臭椿苦酮（5、10、20μM）處理 HL-60 細(xì)胞 48 小時(shí)后

流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，臭椿苦酮處理的 HL-60 細(xì)胞凋亡比例明顯上升（圖2.A）。在 37℃恒溫下用臭椿苦酮（5、10、20μM）處理 HL-60 細(xì)胞 48 小時(shí)后，細(xì)胞凋亡比例從 42.02 上升到 59.68%，其中細(xì)胞凋亡百分比分別是 42.02±0.54，52.05±2.27，59.69±0.25%，均顯著高于對照組的 3.92±0.14%（P<0.05；圖 2.B）。3 臭椿苦酮誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞周期阻滯為了明確臭椿苦酮對 HL-60 細(xì)胞的抗增殖作用是否可歸因于細(xì)胞周期阻滯，運(yùn)用

圖 3 臭椿苦酮誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞 G0/G1 周期阻滯。（A.臭椿苦酮誘導(dǎo) HL-60 細(xì)胞 G0/G 周期阻滯。PI 對 HL-60 細(xì)胞進(jìn)行染色，運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布。（a）對照細(xì)胞組; 用（b）5，（c）10 和（d）20μM 臭椿苦酮分別在 37 C 下處理細(xì)胞 48 小時(shí)。（B）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，臭椿苦酮以劑量依賴的方式增加 G0/G1 期細(xì)胞的百分比；*P<0.05 對比對照組；***P<0.05 對比 5μM 組；##P<0.05 對比 10μM 組。）

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本文編號：2760152