【摘要】：目的:糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic retinopathy,DR)作為糖尿病最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥,危害較大。本研究以人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human retinal endothelial cells,HRECs)作為研究對(duì)象,通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),在細(xì)胞水平研究高葡萄糖環(huán)境對(duì)HRECs的增殖、遷移和血管成形能力等生物學(xué)作用的影響;比較丹參酮IIA(Tanshinone IIA,TSA)對(duì)正常葡萄糖環(huán)境和高糖環(huán)境中HRECs增殖的影響;以及TSA在高糖環(huán)境中對(duì)HRECs遷移和血管成形能力等生物學(xué)作用的影響;進(jìn)一步檢測(cè)TSA對(duì)高糖環(huán)境中HRECs中的VEGF和ICAM-1二個(gè)重要分子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的影響,以探討TSA防治糖尿病視網(wǎng)膜病變的可能及相關(guān)機(jī)制。方法:1、利用CCK8法,分別檢測(cè)在正常葡萄糖(Normal glucose,NG)和高葡萄糖(High glucose,HG)環(huán)境下,不同藥物濃度、不同作用時(shí)間下,丹參酮IIA(TSA)藥物對(duì)HRECs的增殖能力的影響。所設(shè)立的TSA藥物濃度梯度為10、20、30μg/ml,CCK8檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)分別為24 h、48 h、72 h;2、利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在高糖環(huán)境中,不同濃度TSA藥物對(duì)HRECs的遷移能力的影響。劃痕實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用倒置熒光顯微鏡記錄0 h、24 h、48 h的傷口愈合情況;transwell實(shí)驗(yàn)記錄藥物作用24 h后遷移的細(xì)胞數(shù)量;3、利用體外血管成形實(shí)驗(yàn),比較在高糖環(huán)境中不同濃度TSA藥物作用下,各組細(xì)胞成管化情況,以此獲知TSA對(duì)HRECs血管成形的影響;4、采用q RT-PCR、Western blot和Immunofluorescence技術(shù),分析在高糖環(huán)境中,不同濃度TSA藥物作用下,HRECs中的VEGF和ICAM-1的m RNA及蛋白水平表達(dá)的變化;5、所有數(shù)據(jù)均用SPSS 13.0軟件行統(tǒng)計(jì)分析。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,主要采用兩組數(shù)據(jù)的獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和多組數(shù)據(jù)的單因素方差分析(One-way ANOVA),對(duì)于連續(xù)測(cè)量數(shù)據(jù),采用了重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析方法。組間兩兩比較采用LSD方法比較。P0.05認(rèn)為差異有顯著性意義。結(jié)果:1、CCK8法實(shí)驗(yàn)中,高糖環(huán)境的刺激促進(jìn)HRECs的增殖;在正常葡萄糖濃度下,HRECs的增殖能力不受TSA藥物的影響;在高糖環(huán)境中,HRECs的增殖能力受到TSA的抑制,并呈現(xiàn)時(shí)間劑量濃度依賴性,隨著TSA濃度的增加、作用時(shí)間的延長(zhǎng),TSA抑制細(xì)胞增殖的能力逐漸加強(qiáng)。在作用72 h,TSA高濃度組(HG-30組)細(xì)胞增殖受到抑制最明顯;2、劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致:相對(duì)于正常葡萄糖環(huán)境,高糖環(huán)境促進(jìn)HRECs的遷移;在高糖環(huán)境中,TSA抑制HRECs的遷移,并呈現(xiàn)劑量濃度依賴性,TSA高濃度組(HG-30組)抑制遷移的能力最明顯;3、體外成管實(shí)驗(yàn)顯示,與正常葡萄糖環(huán)境相比,高糖環(huán)境中HRECs的成管能力數(shù)量和大小均較強(qiáng);但在高糖環(huán)境中,TSA對(duì)HRECs的成管能力有抑制作用,并呈現(xiàn)劑量濃度依賴性,TSA高濃度組(HG-30組)抑制血管成形的能力最明顯;4、q RT-PCR、Western blot和Immunofluorescence實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常葡萄糖濃度環(huán)境相比,在高糖環(huán)境中HRECs的VEGF及ICAM-1的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)增強(qiáng);但在高糖環(huán)境中,TSA會(huì)明顯下調(diào)VEGF的m RNA及蛋白水平的表達(dá),并呈現(xiàn)劑量濃度依賴性;TSA會(huì)明顯降低ICAM-1的蛋白水平的表達(dá),并呈現(xiàn)劑量濃度依賴性。TSA高濃度組(HG-30組)抑制VEGF及ICAM-1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)的效果最顯著。結(jié)論:1、在高糖環(huán)境中,與正常葡萄糖環(huán)境相比,HRECs的增殖、遷移和成管能力均有一定的促進(jìn)作用;2、TSA對(duì)高糖環(huán)境中培養(yǎng)的HRECs的增殖能力有一定的抑制作用,并呈現(xiàn)時(shí)間劑量濃度依賴性;對(duì)HRECs的遷移和成管能力有一定的抑制作用,并呈現(xiàn)劑量濃度依賴關(guān)系;而TSA對(duì)正常葡萄糖環(huán)境中培養(yǎng)的HRECs的增殖能力無(wú)明顯抑制作用;3、在高糖環(huán)境中,HRECs的VEGF和ICAM-1的m RNA及蛋白表達(dá)增多;而TSA能顯著抑制高糖環(huán)境中HRECs的VEGF和ICAM-1的m RNA及蛋白表達(dá),且呈現(xiàn)劑量濃度依賴關(guān)系。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

分 丹參酮 IIA 對(duì)高糖環(huán)境中人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞體外生物學(xué)作用經(jīng)重復(fù)測(cè)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，結(jié)果表明：在正常葡萄糖環(huán)境下，不同濃度 TSA 對(duì)人視細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*，P > 0.05）。細(xì)胞在同一藥物間作用下（24 h，48 h，72 h），細(xì)胞增殖逐漸增加，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（&，P <同一時(shí)間作用下，不同藥物濃度（10μg/ml，20μg/ml，30 μg/ml）對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)影差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＃，P >0.05）。

2. 正常濃度葡萄糖環(huán)境和高濃度葡萄糖環(huán)境下，NG-0 組與 HG-0 組的 HRECs 細(xì)比較。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，高濃度葡萄糖培養(yǎng)下的細(xì)胞其增殖能力明顯高于正常濃度的細(xì)胞，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**P<0.01）。高糖能夠明顯促進(jìn) HRECs 細(xì)胞的增2. TSA 抑制高糖誘導(dǎo)的 HRECs 遷移細(xì)胞劃痕試驗(yàn)用于觀察 TSA 對(duì)高糖濃度下 HRECs 的遷移能力的影響。首勻鋪板于六孔板，待細(xì)胞完全生長(zhǎng)鋪滿孔板底部后，開始實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞提前隨后開始劃痕，分別在 0、24 和 48 h 拍照記錄，分析傷口愈合情況。結(jié)果表G-TSA 0 和 NG-TSA 0 兩組對(duì)比，隨著時(shí)間的進(jìn)展，高糖組細(xì)胞的劃痕面積，傷口愈合面積增大，表明在高糖環(huán)境的刺激下，HRECs 的遷移能力變強(qiáng)然而，TSA 藥物的加入會(huì)顯著抑制高葡萄糖誘導(dǎo)的 HRECs 遷移能力，藥物濃度依賴性。在 24h 和 48h 拍照記錄，發(fā)現(xiàn)高濃度的 TSA 組傷口愈低濃度的 TSA 組，提示 TSA 藥物濃度越高，該條件下的細(xì)胞遷移能力受到顯（圖 2a 和 b），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05，**P<0.01）。

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7 邵s

本文編號(hào)：2732550