【摘要】：Wilson’s病(Wilson’s Disease,WD)是一種由于位于13號染色體上的ATP7B基因突變,造成銅代謝障礙的常染色體隱性遺傳性疾病。該病病情復雜多變,故臨床上可將其分為潛伏型(癥狀前期型)、腦型、內臟型、腦內臟型等等,其中以腦型患者最為多見,約占患者總數的60%左右。腦型WD患者臨床表現以運動障礙、精神障礙以及帕金森綜合征等為主,其臨床表現與銅離子沉積于腦內,導致海馬、基底節(jié)區(qū)等相關認知區(qū)域受累密切相關。前期研究發(fā)現銅負荷大鼠的學習記憶能力受損可能與其絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路在高銅誘導下活化從而損傷海馬相關神經元有關。故本實驗選取小鼠海馬神經元細胞(HT-22)進行相關研究。因此,研究高銅誘導的海馬神經元細胞損傷機制及其可能的干預途徑,對于臨床腦型WD患者的診治具有重要的意義。銅在細胞內的大量蓄積會促使活性氧(ROS)的大量釋放,導致細胞產生氧化應激反應,從而誘導細胞自噬的發(fā)生。傳統西藥如青霉胺、二巰基丙磺酸鈉等治療WD,雖驅銅效果較好但不良反應大,甚至可能會導致神經精神癥狀進一步惡化,嚴重影響了WD患者的病情與預后。筆者所在單位經多年研究,首提清熱解毒、通腑利濕之治法治療WD,并組方肝豆湯治療該病,臨床效果顯著。前期研究發(fā)現肝豆湯可以下調TX小鼠腦內ASM、Cer、NK等相關蛋白的表達,從而恢復TX小鼠的腦部損傷癥狀。但目前這些研究尚不能完全闡明肝豆湯對高銅誘導神經元損傷的具體療效機制。高銅可誘導神經元發(fā)生氧化應激反應,從而造成神經元細胞大量自噬性死亡。因此我們假設肝豆湯通過調控線粒體自噬相關蛋白來阻斷高銅誘導所造成的線粒體自噬現象,從而緩解神經元損傷,達到保護神經元的作用,改善WD患者的腦損傷癥狀。目的:研究肝豆湯對高銅誘導的HT-22細胞線粒體自噬效應及其可能的作用機制,為中醫(yī)藥診治腦型WD患者提供新的治療靶點和研究思路。方法:(1)采用MTT比色法檢測在不同的時間節(jié)點下,不同劑量的CuSO_4作用于HT-22細胞對其細胞存活率的影響,篩選CuSO_4造模濃度及時間,模擬WD的細胞模型。(2)采用乳酸脫氫酶LDH釋放實驗檢測HT-22細胞LDH漏出。(3)采用二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)探針法經流式細胞儀檢測HT-22細胞中ROS的含量。(4)采用熒光染料JC-1經流式細胞儀檢測HT-22細胞線粒體膜電位。(5)采用透射電鏡法觀察HT-22細胞形態(tài)學變化。(6)采用Western Blot法檢測線粒體自噬相關蛋白PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L的表達。結果:(1)MTT結果顯示:CuSO_4對HT-22細胞的損傷跟藥量和時間呈現一定的正相關性。隨著CuSO_4作用劑量或時間的增加,HT-22細胞的存活率呈現出下降趨勢。(2)MTT結果顯示:CuSO_4作用細胞后LDH漏出率顯著增加(P0.01),肝豆湯血清可以降低經CuSO4誘導后HT-22細胞的LDH漏出率(P0.01,P0.05)。(3)流式細胞儀結果顯示:經DCFH-DA熒光染色后,發(fā)現CuSO_4可顯著增加HT-22細胞內ROS生成(P0.01),肝豆湯血清可顯著抑制CuSO_4誘導的細胞內ROS產生(P0.01,P0.05)。(4)流式細胞儀結果顯示:經JC-1染色后,發(fā)現CuSO_4誘導HT-22細胞線粒體膜電位顯著降低(P0.01),10%和15%肝豆湯血清可抑制CuSO_4誘導的線粒體膜電位降低(P0.01)。(5)透射電鏡結果顯示:正常組細胞內線粒體形態(tài)完整,大小正常,在細胞內正常分布;自噬體則數量較少。模型組細胞內線粒體數目明顯減少,且結構紊亂多空泡化,部分空泡內可見內容物,部分線粒體被包裹進囊泡中;自噬體較大,數量亦明顯增多。肝豆湯組細胞內可見少量空泡,線粒體形態(tài)結構均接近于正常狀態(tài);自噬體較模型組明顯減少。(6)Western blot結果顯示:與正常組對比,模型組細胞內PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L蛋白的表達顯著增加(P0.01)。與模型組對比,肝豆湯血清組Parkin、LC3 A/B、BNIP3L蛋白表達均顯著降低(P0.01)。與模型組相比,10%和15%肝豆湯血清組PINK1蛋白表達顯著降低(P0.01)。結論:高銅可通過誘導HT-22細胞內線粒體氧化應激,上調自噬相關蛋白及基因PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L的表達,導致HT-22細胞發(fā)生自噬性死亡,而肝豆湯可抑制高銅誘導的HT-22細胞線粒體氧化應激,下調自噬相關蛋白PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L的表達,抑制線粒體自噬的發(fā)生,從而阻斷高銅誘導的神經元損傷,達到保護神經的作用。
【學位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

驗結果uSO4造模濃度的篩選MTT 結果顯示：CuSO4對 HT-22 細胞具有損傷作用，且損傷程度與藥量和時現一定的相關性，隨著 CuSO4作用劑量的增加或作用時間的延長，HT-22 細活率呈現出下降的趨勢。實驗數據表明，HT-22 細胞經 250μmol CuSO4作用，存活率接近 IC50，因此選擇該濃度的 CuSO4作為 HT-22 細胞 24h 造模濃見圖 1）

降低其 LDH 漏出（見表 1，圖 2）表 1 肝豆湯對 CuSO4損傷 HT-22 細胞 LDH 漏出的影響（ x±s,n=3）Tan.1 Effect of GDT on LDH Leakage in HT-22 Cells injured by CuSO4（ x±s,n=3）組別 例數（n） LDH t p正常組 3 192.33±21.22模型組 3 397.00±16.37 -17.353 0.0005%肝豆湯組 3 352.67±12.58 3.719 0.02010%肝豆湯組 3 309.00±15.62 6.736 0.00315%肝豆湯組 3 318.00±18.00 5.624 0.005

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