【摘要】：Wilson’s病(Wilson’s Disease,WD)是一種由于位于13號染色體上的ATP7B基因突變,造成銅代謝障礙的常染色體隱性遺傳性疾病。該病病情復(fù)雜多變,故臨床上可將其分為潛伏型(癥狀前期型)、腦型、內(nèi)臟型、腦內(nèi)臟型等等,其中以腦型患者最為多見,約占患者總數(shù)的60%左右。腦型WD患者臨床表現(xiàn)以運(yùn)動障礙、精神障礙以及帕金森綜合征等為主,其臨床表現(xiàn)與銅離子沉積于腦內(nèi),導(dǎo)致海馬、基底節(jié)區(qū)等相關(guān)認(rèn)知區(qū)域受累密切相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)銅負(fù)荷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力受損可能與其絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路在高銅誘導(dǎo)下活化從而損傷海馬相關(guān)神經(jīng)元有關(guān)。故本實驗選取小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞(HT-22)進(jìn)行相關(guān)研究。因此,研究高銅誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷機(jī)制及其可能的干預(yù)途徑,對于臨床腦型WD患者的診治具有重要的意義。銅在細(xì)胞內(nèi)的大量蓄積會促使活性氧(ROS)的大量釋放,導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。傳統(tǒng)西藥如青霉胺、二巰基丙磺酸鈉等治療WD,雖驅(qū)銅效果較好但不良反應(yīng)大,甚至可能會導(dǎo)致神經(jīng)精神癥狀進(jìn)一步惡化,嚴(yán)重影響了WD患者的病情與預(yù)后。筆者所在單位經(jīng)多年研究,首提清熱解毒、通腑利濕之治法治療WD,并組方肝豆湯治療該病,臨床效果顯著。前期研究發(fā)現(xiàn)肝豆湯可以下調(diào)TX小鼠腦內(nèi)ASM、Cer、NK等相關(guān)蛋白的表達(dá),從而恢復(fù)TX小鼠的腦部損傷癥狀。但目前這些研究尚不能完全闡明肝豆湯對高銅誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的具體療效機(jī)制。高銅可誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng),從而造成神經(jīng)元細(xì)胞大量自噬性死亡。因此我們假設(shè)肝豆湯通過調(diào)控線粒體自噬相關(guān)蛋白來阻斷高銅誘導(dǎo)所造成的線粒體自噬現(xiàn)象,從而緩解神經(jīng)元損傷,達(dá)到保護(hù)神經(jīng)元的作用,改善WD患者的腦損傷癥狀。目的:研究肝豆湯對高銅誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞線粒體自噬效應(yīng)及其可能的作用機(jī)制,為中醫(yī)藥診治腦型WD患者提供新的治療靶點(diǎn)和研究思路。方法:(1)采用MTT比色法檢測在不同的時間節(jié)點(diǎn)下,不同劑量的CuSO_4作用于HT-22細(xì)胞對其細(xì)胞存活率的影響,篩選CuSO_4造模濃度及時間,模擬WD的細(xì)胞模型。(2)采用乳酸脫氫酶LDH釋放實驗檢測HT-22細(xì)胞LDH漏出。(3)采用二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)探針法經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測HT-22細(xì)胞中ROS的含量。(4)采用熒光染料JC-1經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測HT-22細(xì)胞線粒體膜電位。(5)采用透射電鏡法觀察HT-22細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。(6)采用Western Blot法檢測線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L的表達(dá)。結(jié)果:(1)MTT結(jié)果顯示:CuSO_4對HT-22細(xì)胞的損傷跟藥量和時間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)性。隨著CuSO_4作用劑量或時間的增加,HT-22細(xì)胞的存活率呈現(xiàn)出下降趨勢。(2)MTT結(jié)果顯示:CuSO_4作用細(xì)胞后LDH漏出率顯著增加(P0.01),肝豆湯血清可以降低經(jīng)CuSO4誘導(dǎo)后HT-22細(xì)胞的LDH漏出率(P0.01,P0.05)。(3)流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示:經(jīng)DCFH-DA熒光染色后,發(fā)現(xiàn)CuSO_4可顯著增加HT-22細(xì)胞內(nèi)ROS生成(P0.01),肝豆湯血清可顯著抑制CuSO_4誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生(P0.01,P0.05)。(4)流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示:經(jīng)JC-1染色后,發(fā)現(xiàn)CuSO_4誘導(dǎo)HT-22細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低(P0.01),10%和15%肝豆湯血清可抑制CuSO_4誘導(dǎo)的線粒體膜電位降低(P0.01)。(5)透射電鏡結(jié)果顯示:正常組細(xì)胞內(nèi)線粒體形態(tài)完整,大小正常,在細(xì)胞內(nèi)正常分布;自噬體則數(shù)量較少。模型組細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目明顯減少,且結(jié)構(gòu)紊亂多空泡化,部分空泡內(nèi)可見內(nèi)容物,部分線粒體被包裹進(jìn)囊泡中;自噬體較大,數(shù)量亦明顯增多。肝豆湯組細(xì)胞內(nèi)可見少量空泡,線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)均接近于正常狀態(tài);自噬體較模型組明顯減少。(6)Western blot結(jié)果顯示:與正常組對比,模型組細(xì)胞內(nèi)PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L蛋白的表達(dá)顯著增加(P0.01)。與模型組對比,肝豆湯血清組Parkin、LC3 A/B、BNIP3L蛋白表達(dá)均顯著降低(P0.01)。與模型組相比,10%和15%肝豆湯血清組PINK1蛋白表達(dá)顯著降低(P0.01)。結(jié)論:高銅可通過誘導(dǎo)HT-22細(xì)胞內(nèi)線粒體氧化應(yīng)激,上調(diào)自噬相關(guān)蛋白及基因PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L的表達(dá),導(dǎo)致HT-22細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡,而肝豆湯可抑制高銅誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞線粒體氧化應(yīng)激,下調(diào)自噬相關(guān)蛋白PINK1、Parkin、LC3 A/B、BNIP3L的表達(dá),抑制線粒體自噬的發(fā)生,從而阻斷高銅誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷,達(dá)到保護(hù)神經(jīng)的作用。
【學(xué)位授予單位】：安徽中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

驗結(jié)果uSO4造模濃度的篩選MTT 結(jié)果顯示：CuSO4對 HT-22 細(xì)胞具有損傷作用，且損傷程度與藥量和時現(xiàn)一定的相關(guān)性，隨著 CuSO4作用劑量的增加或作用時間的延長，HT-22 細(xì)活率呈現(xiàn)出下降的趨勢。實驗數(shù)據(jù)表明，HT-22 細(xì)胞經(jīng) 250μmol CuSO4作用，存活率接近 IC50，因此選擇該濃度的 CuSO4作為 HT-22 細(xì)胞 24h 造模濃見圖 1）

降低其 LDH 漏出（見表 1，圖 2）表 1 肝豆湯對 CuSO4損傷 HT-22 細(xì)胞 LDH 漏出的影響（ x±s,n=3）Tan.1 Effect of GDT on LDH Leakage in HT-22 Cells injured by CuSO4（ x±s,n=3）組別 例數(shù)（n） LDH t p正常組 3 192.33±21.22模型組 3 397.00±16.37 -17.353 0.0005%肝豆湯組 3 352.67±12.58 3.719 0.02010%肝豆湯組 3 309.00±15.62 6.736 0.00315%肝豆湯組 3 318.00±18.00 5.624 0.005

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本文編號：2732238