【摘要】：金茵清熱口服液是湖北中醫(yī)藥大學(xué)聯(lián)合十堰市太和醫(yī)院研制的復(fù)方中藥制劑,由金銀花、茵陳、梔子、大黃、黃芪、甘草、連翹、丹參8味中藥材組成。該方在前期經(jīng)過(guò)了處方優(yōu)化、毒性、穩(wěn)定性、藥效學(xué)、臨床療效及抗流感病毒實(shí)驗(yàn)等研究,證明其具有清熱解毒、活血涼血等功效,用于治療流感臨床療效顯著,同時(shí)能夠提高機(jī)體的免疫功能。在現(xiàn)代的中醫(yī)藥理論及實(shí)踐中均證明了中醫(yī)藥能夠通過(guò)影響機(jī)體的免疫功能達(dá)到一定的治療效果。研究表明,許多中藥是通過(guò)Toll樣受體(Toll likereceptors,TLRs)信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。課題組通過(guò)金茵清熱口服液抗甲型H1N1流感病毒致Hep-2細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),試藥能顯著上調(diào)Hep-2細(xì)胞的抗病毒因子IFN-1α和TNF-α水平,下調(diào)炎性因子如白介素IL-1α和IL-6水平;因此,為探索金茵清熱口服液對(duì)免疫細(xì)胞的作用及其機(jī)制,本研究利用人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),研究金茵清熱口服液對(duì)免疫細(xì)胞中TLRs信號(hào)通路的作用,及其信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白的影響,探究TLRs信號(hào)通路在金茵清熱口服液發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用中的作用。目的:探索金茵清熱口服液(試藥)能否通過(guò)TLRs信號(hào)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用;研究金茵清熱口服液通過(guò)哪些TLRs信號(hào)通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用;進(jìn)一步闡述金茵清熱口服液介導(dǎo)的TLR2信號(hào)免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制。方法:1.TLR1-10及GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立采用LPS孵育PBMC,提取PBMC總RNA作為模板,Primer 5.0引物軟件設(shè)計(jì)TLR1-10及GAPDH引物,PCR法得到TLR1-10及GAPDH擴(kuò)增產(chǎn)物,制備TLR1-10及GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品,分別建立不同的實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,并對(duì)該方法擴(kuò)增效率及特異性進(jìn)行檢測(cè)。2.金茵清熱口服液對(duì)PBMC中TLRs mRNA表達(dá)的影響用不同濃度的試藥孵育PBMC,采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性,計(jì)算試藥對(duì)細(xì)胞的最大無(wú)毒濃度(TC0);設(shè)空白對(duì)照組和試藥組,RT-PCR檢測(cè)TLR1-10 mRNA的表達(dá)情況。3.金茵清熱口服液對(duì)PBMC中TLR2信號(hào)通路的影響利用RT-PCR法和Western Blot法檢測(cè)空白對(duì)照組和試藥組PBMC 中相關(guān)信號(hào)分子 TLR2、MyD88、IRAK4、TRAF6、IRF3 mRNA和蛋白的表達(dá)情況,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-1α、IL-6、TNF-α、IFN-α的分泌水平;分別設(shè)抑制劑組、空白對(duì)照組、試藥組、激動(dòng)劑組,提取核蛋白和漿蛋白,Western Blot法檢測(cè)IRF3和NF-κB p65的核轉(zhuǎn)位,并進(jìn)行灰度分析。結(jié)果:1.建立了 TLR1-10及GAPDH的標(biāo)準(zhǔn)曲線:各基因的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度間線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2均大于0.995以上;擴(kuò)增效率基本都大于90%;其檢測(cè)下限為1×103 copies·μl-1,證明其靈敏度高;無(wú)引物二聚體及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn),可以反應(yīng)這些引物的特異性良好。2.金茵清熱口服液顯著上調(diào)PBMC的TLR1、2、6 mRNA表達(dá):MTT法檢測(cè)PBMC存活率,得到TC0為2.015 mg·mL-1;RT-PCR法結(jié)果顯示,試藥組中TLR5、TLR7、TLR8 mRNA水平分別下調(diào)53%、21%、15%,而 TLR1 上調(diào) 4.11 倍,TLR2 上調(diào) 6.32 倍,TLR6 上調(diào) 5.58 倍,TLR9 上調(diào) 1.53 倍(p0.05)。3.金茵清熱口服液活化MyD88依賴的TLR信號(hào)通路:試藥對(duì)TLR2、MyD88、TRAF6 mRNA 表達(dá)分別上調(diào) 5.93 倍、1.77 倍、2.95倍;對(duì)MyD88、TRAF6蛋白的表達(dá)分別上調(diào)1.26倍、1.24倍;對(duì)細(xì)胞因子IL-1α、IL-6的表達(dá)下調(diào)55%、61%;TNF-α、IFN-α的分泌水平上調(diào)4.3倍、2.9倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4.TLR2抑制劑可以阻斷金茵清熱口服液對(duì)PBMC的免疫活化作用:金茵清熱口服液處理PBMC后,IRF3及NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位,但是經(jīng)過(guò)TLR2抑制劑預(yù)處理后,IRF3和NF-κB的核轉(zhuǎn)位顯著抑制,甚至低于未經(jīng)任何處理的空白對(duì)照組。相反,TLR2激動(dòng)劑預(yù)處理可以進(jìn)一步上調(diào)金茵清熱口服液介導(dǎo)的IRF3和NF-κB的核轉(zhuǎn)位。結(jié)論:1.金茵清熱口服液顯著上調(diào)PBMC中TLR1、2、6mRNA表達(dá),提示其可能主要通過(guò)TLR1、TLR2及TLR6信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮免疫調(diào)控作用;2.金茵清熱口服液可以上調(diào)PBMC的抗病毒天然免疫;3.金茵清熱口服液可以活化MyD88依賴型TLR信號(hào)通路,而且TLR2抑制劑可以阻斷金茵清熱口服液介導(dǎo)的IRF3和NF-κB的核轉(zhuǎn)一位,表明TLR2信號(hào)通路在金茵清熱口服液的免疫調(diào)節(jié)功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

３．２邋ＲＴ－ＰＣＲ檢測(cè)試藥對(duì)ＴＬＲ１－１０邋ｍＲＮＡ表徸的影響逡逑提取ＰＢＭＣ的ＲＮＡ，Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ檢測(cè)試藥對(duì)ＴＬＲ１－１０的影逡逑響（見(jiàn)圖５），結(jié)果顯示，ＴＬＲ１－１０的２－＾＾分別為：４．１１２±０．３０６、逡逑６．３２士０．０４３、１．４０４士０．０２５、１．０２８±０．００３、０．４６６±０．０６７、５．５８±０．２０５、逡逑０．７９±０．０４７、０．８４７士０．０１２、１．５３４土０．２４３、０．９２±０．０４３；表明試藥組中逡逑ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８ｍＲＮＡ邋水平分別下調(diào)邋５３％、２１％、１５％；其他逡逑ＴＬＲｓ均比空白組的ｍＲＮＡ表達(dá)水平高，ＴＬＲ１上調(diào)４．１１倍，ＴＬＲ２逡逑上調(diào)邋６．３２邋倍，ＴＬＲ６邋上調(diào)邋５．５８邋倍，ＴＬＲ９邋上調(diào)邋１．５３邋倍（ｐ＜０．０５）。逡逑１９逡逑

分別用抑制劑、試藥、激動(dòng)劑孵育ＰＢＭＣ，具體操作如“２．４”逡逑提取各組ＰＢＭＣ中的核蛋白及漿蛋白，Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ法檢測(cè)核蛋白及漿逡逑蛋白中的表達(dá)（見(jiàn)圖９）。逡逑＊＊．＃rP歟椋簦rP停]3?ＩＲＦ３邐ｍｍｍｍｍｍ逡逑ｉ蛋＊邐該圣合逡逑圖９．試藥處理前后漿蛋白及核蛋白中ＩＲＦ３、ＮＦ－ｋＢ的表達(dá)情況逡逑Ｆｉｇｕｒｅ９邋．Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ＩＲＦ３邋ａｎｄ邋ＮＦ－？ｃＢ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｓｅｒｕｍ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ａｎｄ逡逑ｎｕｃｌｅａｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ＰＢＭＣ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ／ｗｉｔｈｏｕｔ邋ＪＹＱＲＯＬ逡逑３５逡逑

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 范建衛(wèi);;小兒雙金清熱口服液對(duì)風(fēng)熱感冒患兒癥狀改善作用分析[J];內(nèi)蒙古中醫(yī)藥;2017年02期

2 劉婧;;小兒雙金清熱口服液佐治甲型流感的臨床研究[J];包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2017年03期

3 呂本強(qiáng);范積平;張貞良;任雅瑾;;高效液相色譜法測(cè)定銀龍清熱口服液中綠原酸的含量[J];華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志;2017年07期

4 鄭江萍;葉方;楊光義;黃良永;;金茵清熱口服液提取工藝比較[J];中國(guó)現(xiàn)代中藥;2016年02期

5 袁曉軍;李鳳;丁英;汪瑞芳;李覺(jué)慧;;口腔霧化藥物吸入聯(lián)合小兒雙金清熱口服液治療皰疹性口炎的臨床療效[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2016年06期

6 范友強(qiáng);;高效液相色譜法測(cè)定小兒清熱口服液中綠原酸的含量[J];中國(guó)新技術(shù)新產(chǎn)品;2015年06期

7 朱金媛;鄒鳳;何軍;郝信東;田景振;崔清華;;小兒雙金清熱口服液體內(nèi)外抗菌效果研究[J];藥學(xué)研究;2015年04期

8 葉方;李麗;楊光義;黃良永;張晨寧;魏晉寶;;金茵清熱口服液半仿生提取醇沉濃度優(yōu)選[J];中國(guó)藥師;2015年05期

9 尹麗娜;;聯(lián)用雙金清熱口服液和氨溴特羅口服液治療小兒支氣管炎的效果研究[J];當(dāng)代醫(yī)藥論叢;2015年17期

10 張桂平;劉金和;張文遠(yuǎn);;小兒雙金清熱口服液聯(lián)合利巴韋林治療手足口病68例[J];中國(guó)藥業(yè);2015年22期

相關(guān)會(huì)議論文 前5條

1 孫卓健;;眾金清熱口服液急性毒性試驗(yàn)研究進(jìn)展[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)與中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)食品衛(wèi)生學(xué)分會(huì)聯(lián)合學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)第5次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2017年

2 孫卓健;郝智慧;趙莉;;眾金清熱口服液亞慢性毒性試驗(yàn)研究[A];中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)與中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)食品衛(wèi)生學(xué)分會(huì)聯(lián)合學(xué)術(shù)研討會(huì)暨中國(guó)毒理學(xué)會(huì)獸醫(yī)毒理學(xué)委員會(huì)第5次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)會(huì)議論文集[C];2017年

3 齊廣才;劉珍葉;吳江瑞;崔生飛;趙勃衡;;HPLC法同時(shí)測(cè)定兒童清熱口服液中3種有效成分的含量[A];第21屆全國(guó)色譜學(xué)術(shù)報(bào)告會(huì)及儀器展覽會(huì)會(huì)議論文集[C];2017年

4 盛勇;呂元琦;周連文;袁倬斌;;區(qū)帶毛細(xì)管電泳法測(cè)定黃芩甙元、黃芩甙和綠原酸[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第十三屆有機(jī)分析與生物分析學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2005年

5 李慶德;李旭桂;鄭錦坤;黃紅雯;張毅;;HPLC法測(cè)定抗病毒清熱口服液中綠原酸含量[A];2016年廣東省藥師周大會(huì)論文集[C];2015年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前4條

1 本報(bào)記者 劉妙妙;藥店為何難尋便宜藥?[N];北京社區(qū)報(bào);2011年

2 王秋冬;藥店暑期銷售抓四個(gè)重點(diǎn)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2007年

3 記者 張忠田;山東高校中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新獲突破[N];中國(guó)中醫(yī)藥報(bào);2015年

4 王磊　三尺劍;從醫(yī)50年,他寫(xiě)好了一個(gè)“德”字[N];洛陽(yáng)日?qǐng)?bào);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前6條

1 王敏;金茵清熱口服液通過(guò)TLR通路介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)作用及機(jī)制研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2019年

2 任攀;金茵清熱口服液體外抗甲型H1N1流感病毒作用及機(jī)制的研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2018年

3 劉澤干;金茵清熱口服液的質(zhì)量評(píng)價(jià)與臨床療效研究[D];湖北中醫(yī)藥大學(xué);2014年

4 孟慶闊;清熱口服液治療小兒感冒表熱里實(shí)證的臨床療效觀察[D];黑龍江中醫(yī)藥大學(xué);2011年

5 劉曉菲;銀翹馬勃解毒顆粒治療皰疹性咽峽炎濕熱毒蘊(yùn)證的臨床研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2014年

6 聶恒磊;蒲金麻甘顆粒治療小兒急性支氣管炎濕熱證的臨床觀察[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2731550