【摘要】：目的:知母是百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖,具有清熱瀉火、滋陰潤燥的功效。用于內(nèi)熱消渴,外感熱病,肺熱燥咳,骨蒸潮熱,高熱煩渴,腸燥便秘等癥。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)知母鹽炙后具有顯著的降血糖作用,通過鹽炙前后化學(xué)成分的對(duì)比研究,發(fā)現(xiàn)了3種鹽炙后增量成分:知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷。本課題圍繞知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷這三種增量成分,進(jìn)行體外降糖活性及藥代動(dòng)力學(xué)研究,對(duì)其與鹽知母降糖活性關(guān)系進(jìn)行確認(rèn),進(jìn)一步解析鹽知母炮制增效的原理,為臨床合理使用鹽知母提供理論依據(jù)。材料與方法:材料:知母藥材購于河北省易縣,知母飲片購于四川新荷花中藥飲片股份有限公司。經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院(大連校區(qū))翟延君教授鑒定為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根莖。方法:1.鹽知母增量成分含量測定采用UPLC-MS液質(zhì)聯(lián)用技術(shù),建立鹽知母中三種增量成分知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ和芒果苷的含量測定方法,比較不同提取方式鹽知母中3種增量成分含量變化,分析3種增量成分與之前藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)應(yīng)關(guān)系,對(duì)鹽知母增量成分的降糖作用進(jìn)一步確認(rèn)。對(duì)鹽知母乙醇提取物進(jìn)行不同極性部位分離,得到氯仿、乙酸乙酯部位,采用UPLC-MS液質(zhì)聯(lián)用法測定氯仿部位、乙酸乙酯部位3種成分的含量。分析不同樣品知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷的含量,結(jié)合前期鹽知母活性部位篩選的結(jié)果,分析、確認(rèn)鹽知母增量成分的降糖作用。2.鹽知母增量成分的降血糖作用研究通過探討知母鹽制后增量成分知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷對(duì)HepG-2細(xì)胞葡萄糖消耗、對(duì)NIT-1胰島β細(xì)胞保護(hù)及修護(hù)作用的影響,進(jìn)一步驗(yàn)證知母鹽炙后降糖作用增強(qiáng)的炮制原理。將HepG-2細(xì)胞分為空白對(duì)照組、知母皂苷AⅢ組、知母皂苷BⅢ組、芒果苷組、陽性藥二甲雙胍組,在5%CO_2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,饑餓12小時(shí),再加入不同濃度相應(yīng)的含藥或不含藥血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)24h,采用葡萄糖試劑盒檢測培養(yǎng)液中的葡萄糖含量,葡萄糖消耗實(shí)驗(yàn)之后,加入cck-8試劑培養(yǎng)2h,用酶標(biāo)儀測定吸光度(OD),并計(jì)算存活率(IC值);采用胰島素誘導(dǎo)建立胰島素抵抗HepG-2細(xì)胞模型,同上法比較知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ以及芒果苷對(duì)胰島素抵抗的HepG-2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響。將NIT-1胰島β細(xì)胞分為空白對(duì)照組、知母皂苷AⅢ組、知母皂苷BⅢ組、芒果苷組,空白組加含血清1640培養(yǎng)基,其余各組分別加入STZ和不同濃度相應(yīng)的含藥的血清培養(yǎng)基,在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h,加入cck-8試劑,培養(yǎng)2h,用酶標(biāo)儀測定吸光度(OD);同法培養(yǎng)之后分別采用試劑盒測定NIT-1胰島β細(xì)胞的一氧化氮、丙二醛以及超氧化物歧化酶的含量。3.鹽知母增量成分藥代動(dòng)力學(xué)比較研究分別給大鼠灌胃生、鹽知母醇提物,以知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ以及芒果苷為指標(biāo),采用Waters Xevo TQD三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用色譜儀對(duì)血漿等樣品定量分析,并應(yīng)用DAS3.2.7數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)生、鹽知母在大鼠體內(nèi)的原型藥物濃度、吸收速率進(jìn)行比較,分析知母、鹽知母中各指標(biāo)性成分AUC_(0-t)、AUC_(0-∞),有無顯著性差異。分別給大鼠灌胃生、鹽知母醇提物,不同時(shí)間點(diǎn)收集大鼠糞便、尿液,進(jìn)行相應(yīng)的樣品處理,采用UPLC-TOF-MS液質(zhì)聯(lián)用色譜儀對(duì)大鼠排泄產(chǎn)物中的知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ以及芒果苷原型藥物含量進(jìn)行比較,并結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)庫分析數(shù)據(jù),分析生、鹽知母中知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷在大鼠體內(nèi)原型藥物的排泄量。結(jié)果:1.鹽知母增量成分的含量測定鹽知母醇提物中知母皂苷AⅢ,知母皂苷BⅢ、芒果苷含量均高于水提物,三種增量成分均具有顯著性差異。結(jié)合前期的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,知母皂苷AⅢ,知母皂苷BⅢ和芒果苷是鹽知母降糖作用增強(qiáng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。在鹽知母醇提物的氯仿萃取層、乙酸乙酯萃取層中,乙酸乙酯層的知母皂苷AⅢ、芒果苷的含量均高于氯仿層,而氯仿中知母皂苷BⅢ的含量遠(yuǎn)高于乙酸乙酯,結(jié)合前期的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,因氯仿層的藥效優(yōu)于乙酸乙酯層,由此推測,在藥效實(shí)驗(yàn)中知母皂苷BⅢ具有更顯著的降糖活性。2.鹽知母增量成分的降血糖作用研究知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷各個(gè)濃度組均能使正常組HepG-2細(xì)胞的葡萄糖消耗增加,與空白對(duì)照組相比均有顯著性差異(P0.01或P0.05)。以STZ造模后,與空白對(duì)照組比較,模型組細(xì)胞葡萄糖消耗量顯著降低(P0.05),說明HepG-2細(xì)胞胰島素抵抗模型建立成功;知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷各個(gè)濃度組均能使胰島素抵抗HepG-2細(xì)胞葡萄糖消耗增加,與模型對(duì)照組相比均有顯著性差異(P0.01或P0.05)。cck-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷濃度分別為1.0μg/mL、1.0μg/mL、0.02μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率IC值大于98%。較與模型組相比,知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ以及芒果苷都可改善NIT-1胰島β細(xì)胞的NO水平,其中知母皂苷BⅢ組在4μg/mL改善NIT-1胰島β細(xì)胞的NO水平尤為顯著(P0.05);由SOD活力結(jié)果可見,模型組活力較對(duì)照組明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),知母皂苷AⅢ組、知母皂苷BⅢ組和芒果苷組與模型組相比,有提高SOD活力的趨勢;知母皂苷BⅢ(20μg/ml+STZ)組與模型組相比,能明顯增加SOD活力(P0.05);MDA活力結(jié)果顯示,模型組活力較對(duì)照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),知母皂苷AⅢ組、知母皂苷BⅢ組和芒果苷組與模型組相比,有降低MDA活性的趨勢,且芒果苷組作用尤為顯著(P0.01)。推測知母鹽制后增量成分可能通過改善NO、MDA、SOD途徑修護(hù)胰島β細(xì)胞損傷。2.鹽知母增量成分的藥代動(dòng)力學(xué)研究大鼠分別灌胃生知母、鹽知母提取物后,血漿中知母皂苷AⅢ的達(dá)峰濃度Cmax生知母為4.483±0.508(mg/L),半衰期t1/2生知母為1.818±0.467h;Cmax鹽知母為2.183±0.440(mg/L),半衰期t1/2鹽知母為2.062±0.256h,血漿中平均滯留時(shí)間MRT_(0-t)、MRT_(0-∞)延長。知母皂苷AⅢ血藥濃度-時(shí)間曲線下面積AUC_(0-t)生知母為16.463±4.203(mg/L*~h),AUC_(0-∞)生知母為16.48±4.216(mg/L*~h);AUC_(0-t)鹽知母為7.159±1.378(mg/L*~h),AUC_(0-∞)鹽知母為7.163±1.382(mg/L*~h)。知母皂苷BⅢ的達(dá)峰濃度Cmax生知母為13.45±3.663(mg/L),半衰期t1/2生知母為2.519±0.788h;Cmax鹽知母為12.717±2.257(mg/L),半衰期t1/2鹽知母為2.665±0.516h,血漿中平均滯留時(shí)間MRT_(0-t)、MRT_(0-∞)延長。知母皂苷BⅢ血藥濃度-時(shí)間曲線下面積AUC_(0-t)生知母為75.596±29.438(mg/L*~h),AUC_(0-∞)生知母為75.959±29.384(mg/L*h);AUC_(0-t)鹽知母為101.817±25.414(mg/L*~h),AUC_(0-∞)鹽知母為102.355±25.155mg/L*h。芒果苷的達(dá)峰濃度Cmax生知母為33.917±2.559(mg/L),半衰期t1/2生知母為3.513±0.358h;Cmax鹽知母為33.637±4.675(mg/L),半衰期t1/2鹽知母為5.134±1.045h,血漿中平均滯留時(shí)間MRT_(0-t)、MRT_(0-∞)延長。芒果苷血藥濃度-時(shí)間曲線下面積AUC_(0-t)生知母為167.746±24.332(mg/L*~h),AUC_(0-∞)生知母為171.289±25.781(mg/L*~h);AUC_(0-t)鹽知母為202.742±53.526(mg/L*~h),AUC_(0-∞)鹽知母為210.698±55.206(mg/L*~h)。大鼠分別灌胃生知母、鹽知母提取物后,定點(diǎn)(0~6h,6~12h,12~24h,24~36h,36~48 h)收集其排泄的尿液及糞便,建立UPLC-MS研究生、鹽知母大鼠體內(nèi)排泄途徑研究的方法,根據(jù)不同時(shí)間生、鹽知母中知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷在尿液、糞便中的含量,計(jì)算生、鹽知母中知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷在大鼠尿液、糞便中累積排泄量,尿液在24小時(shí)內(nèi),生知母組的排泄量:知母皂苷AⅢ(122.38±3.72)、知母皂苷BⅢ(22.80±1.39)、芒果苷(53.88±1.30);而在糞便中,知母皂苷AⅢ(30.14±1.49)、知母皂苷BⅢ(11.71±1.44)、芒果苷(23.19±0.85)。尿液在24小時(shí)內(nèi),鹽知母組的排泄量:知母皂苷AⅢ(124.75±5.51)、知母皂苷BⅢ(24.75±3.41)、芒果苷(71.24±2.38);而在糞便中,知母皂苷AⅢ(36.72±2.20)、知母皂苷BⅢ(13.22±2.22)、芒果苷(49.63±1.82)。研究中還發(fā)現(xiàn),知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷在大鼠尿液、糞便中以原型形式排泄的量較少。推測知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷可能主要以代謝產(chǎn)物的形式進(jìn)行體內(nèi)消除,因此有必要對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究,為最終確定其代謝途徑和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。結(jié)論:鹽知母中的增量成分知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷均有降糖作用,且鹽炙后能增加知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ及芒果苷在大鼠體內(nèi)的吸收,與前期證明的鹽知母降糖作用直接相關(guān),是鹽知母炮制增效的物質(zhì)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R284;R285.5
【圖文】：

鹽知母醇提物供試品的總電子流圖

鹽知母水提物供試品的總電子流圖

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本文編號(hào)：2731124