【摘要】：目的:近年所見何首烏的毒性反應(yīng)中,屢經(jīng)報道的為對肝臟的損害。從細(xì)胞、分子水平研究何首烏肝損傷的毒性機(jī)制是常用的方法,但是近年來的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群與肝臟疾病病程的發(fā)生、發(fā)展有很大的相關(guān)性。目前罕見關(guān)于何首烏肝損傷與腸道菌群的關(guān)系的文獻(xiàn)報道,本研究旨在本課題組前期建立的LPS誘導(dǎo)何首烏的大鼠肝損傷評價模型的基礎(chǔ)上,采用Illumina高通量測序技術(shù)和實時熒光定量PCR(q RT-PCR)研究何首烏肝損傷大鼠腸道中棲息的微生物的變化,探討其可能的毒性作用機(jī)制,為何首烏在臨床、保健等領(lǐng)域合理、科學(xué)應(yīng)用提供理論參考和依據(jù)。方法:參考本課題組前期建立的由LPS激活的何首烏肝損傷動物評價模型的方法,將所有實驗動物任意組合為未處理(C)組、LPS(L)組、LPS聯(lián)合對乙酰氨基酚給藥(LA)組、單獨(dú)給予何首烏(P)組和LPS聯(lián)合何首烏給藥(LP)組,6只動物/組;共4個時間點(diǎn):即第2小時、第14小時、第5天和第8天,其中第2小時只有C組和L組(此時所有實驗SD大鼠只做給予LPS和未給予LPS處理的區(qū)別),其他3個時間點(diǎn)均含以上5個組別。實驗當(dāng)天,L、LA和LP組大鼠尾iv給予0.004 g/Kg的LPS,C和P組以同樣的方式iv生理鹽水;給予LPS 2小時后,LA組大鼠ig 0.625 g/Kg的APAP,P組和LP組大鼠ig 12 g生藥/Kg的何首烏,此后時間,服用藥物頻率為1次/d,周期為一周,并記錄不同時間點(diǎn)不同組別大鼠體重。取2、14 h、5、8 d不同組別大鼠的血液樣品和肝臟組織,其中血液樣品用于分析ALT、AST和LPS值變化,肝臟組織用于記錄肝重及制成病理片觀察組織病變;取以上4個時間點(diǎn)C組、L組、P組和LP組大鼠的糞便樣品,提取糞便中微生物的總DNA,DNA質(zhì)檢合格后PCR擴(kuò)增,然后對16S r DNA的V4可變區(qū)進(jìn)行高通量測序,檢測本研究中何首烏肝損傷大鼠腸道菌群的α和β多樣性、菌群的相對豐富程度、LEf SE檢測尋找差異物種,最后采用q RT-PCR法驗證高通量測序所得出差異物種的量化分析結(jié)果。結(jié)果:經(jīng)LPS誘導(dǎo)2小時后,與C組比較,L組大鼠血清檢測發(fā)現(xiàn)ALT、AST和LPS值顯著增大,體重明顯減輕,肝臟出現(xiàn)輕微地腫脹;到第8天時,與C組比較,P組動物各指標(biāo)檢測正常,L組ALT、AST和LPS值的改變不具有統(tǒng)計學(xué)意義,體重恢復(fù)增長,肝臟HE染色觀察發(fā)現(xiàn)少量微小肉芽腫;與L組比較,LA組ALT、AST和LPS值顯著升高,體重增長受到抑制,且肝組織病理檢查可見肝實質(zhì)多處散在微小肉芽腫和淋巴細(xì)胞浸潤,LP組大鼠體重顯著下降,且肝組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)肝實質(zhì)多處散在微小肉芽腫和輕度變性的肝細(xì)胞,結(jié)果提示LPS誘導(dǎo)何首烏的肝臟損害動物模型已建立,可用于何首烏肝損傷的進(jìn)一步研究。對不同時間點(diǎn)不同組別共54個大鼠糞便樣品進(jìn)行Illumina高通量測序分析,共獲得3429945個原始數(shù)據(jù),3402523個高質(zhì)量Tags,有效數(shù)據(jù)數(shù)為3177193,總堿基數(shù)為803105345 nt,平均14872321.2 nt,序列平均長度為253 bp。α多樣性分析發(fā)現(xiàn),稀釋曲線表明本研究所測的數(shù)據(jù)量合理,物種累積曲線表明本研究所用樣本量充足,可進(jìn)行下一步分析;α多樣性指數(shù)——辛普森、Chao1和ACE指數(shù)均無異常變化,但是香濃指數(shù)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)LPS聯(lián)合何首烏給藥7天后大鼠腸道中棲息著微小生命體的種類增多,結(jié)構(gòu)趨向于復(fù)雜化。β多樣性結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),主成分分析、主坐標(biāo)分析表明不同時間點(diǎn)各組大鼠腸道微生物菌落結(jié)構(gòu)差異不明顯,但基于加權(quán)Unifrac距離的UPGMA聚類分析發(fā)現(xiàn)其有一定的差異。且LEf SE分析也顯示各組間存在著不同的具有顯著性差異的差異物種,說明了不同時間點(diǎn)LPS聯(lián)合何首烏給藥組與其他組別微生物結(jié)構(gòu)存在一定的差異。Illumina高通量測序和實時熒光定量PCR法研究均發(fā)現(xiàn),第14小時,與C組比較,給予LPS的組別(L組和LP組)大鼠表現(xiàn)為腸桿菌科細(xì)菌數(shù)顯著升高;隨著何首烏給藥次數(shù)的增加,與C組和L組比較,LPS聯(lián)合何首烏給藥組大鼠表現(xiàn)為毛螺旋菌科、腸球菌科細(xì)菌數(shù)增加,乳桿菌屬細(xì)菌數(shù)減少,說明了LPS聯(lián)合何首烏給藥組大鼠腸道微生物菌落在第8天出現(xiàn)了一定程度的菌群失衡。結(jié)論:1.LPS誘導(dǎo)何首烏的肝臟損害動物評價模型的構(gòu)建已完成,可用于進(jìn)一步的關(guān)聯(lián)性分析和研究。2.何首烏肝損傷大鼠腸道微生物菌群的多樣性增加,菌種豐度發(fā)生了變化表現(xiàn)為腸球菌科和毛螺旋菌科細(xì)菌數(shù)增加,乳桿菌屬細(xì)菌數(shù)減少,何首烏肝損傷大鼠腸道微生物出現(xiàn)了輕度失調(diào)的現(xiàn)象。3.Illumina高通量測序和實時熒光定量PCR法在對微生物進(jìn)行定量分析時,具有良好的一致性,但是前者可得到更全面地、更有深度的微生物信息,更具有優(yōu)勢。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 1 “腸肝軸”之間的互動Fig.1 The interaction of Liver-gut-axis群研究概述與分析技術(shù)息著近千種微生物，數(shù)量近 1014個[40]，它們與宿主存在著互惠體營養(yǎng)吸收、腸道免疫、作為信息呈遞的載體等過程[41]。這些體的“代謝器官”[42]，參與機(jī)體的不同代謝過程，可通過參與膽質(zhì)的代謝過程[43]而影響“腸肝循環(huán)”和“腦腸軸”[44]。已有文獻(xiàn)報[45]、代謝功能[46-48]、中樞神經(jīng)系統(tǒng)[49]等異常導(dǎo)致的疾病有關(guān)。究常用的科學(xué)技術(shù)為我們更有深度、更加系統(tǒng)地了解腸道菌群培養(yǎng)技術(shù)、變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Elec、溫度梯度凝膠電泳（TemperatureGradient Gel Electrophoresi片（DNA microarrays）技術(shù)、實時熒光定量 PCR（Real-timeR）技術(shù)和新一代測序（Next Generation Sequencing, NGS）技術(shù)

圖 1-1 何首烏醇提液一、二級質(zhì)譜圖（負(fù)離子模式）Fig1-1 The primary and secondary mass spectra of Polygonum multiflorum ethanolextracts (negative ion mode)（圖中，a、b 分別表示一、二級質(zhì)譜；1 為兒茶素；2 為大黃素；3 為沒食子酸；4 為大黃素甲醚和/或大黃酸；5 為大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷；6 為二苯乙烯苷）1.2 動物SD 品種大鼠，SPF 級，雄性，體質(zhì)量（170~190g），購于北京維通利華實驗動物科技有限公司，動物合格證編號 SCXK（京）2012-0001。所有動物于軍科院六所的安評中心（NBCDSER）GLP 實驗室環(huán)境中進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，并每天模擬照明狀態(tài)下 12小時，黑暗狀態(tài)下 12 小時，溫度控制在 20℃-24℃，濕度保持在 40%-70%，自由飲食、水。所有動物至少適應(yīng)性飼養(yǎng) 72 小時后供試。1.3 儀器儀器名稱 生產(chǎn)廠家

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2731085