發(fā)布時(shí)間：2020-06-26 23:08

【摘要】：【研究背景】太陽(yáng)輻射包含紫外線(Ultraviolet,UV)、可見(jiàn)光及紅外線。而UV輻射是最具有生物學(xué)效應(yīng)的部分,對(duì)人類(lèi)的健康及疾病有著最大的影響。陽(yáng)光中的UV根據(jù)生物學(xué)作用差異分為三類(lèi):長(zhǎng)波紫外線(Ultraviolet A,UVA,320㧟400 nm)、中波紫外線(Ultraviolet B,UVB,280㧟320 nm)、短波紫外線(Ultraviolet C,UVC,200㧟280 nm)。由于臭氧層的折射、散射作用,大部分UVB、幾乎全部UVC均被吸收,無(wú)法到達(dá)地球表面。所以生活在地球表面的人類(lèi)主要受UVA及少量UVB的輻射。皮膚作為我們?nèi)梭w最大的器官,是抵御外界機(jī)械、生物、化學(xué)、物理等各種刺激的第一道防線。UV是造成皮膚損傷、破壞皮膚屏障的關(guān)鍵性因素;長(zhǎng)期、累積或大劑量UV照射可以導(dǎo)致急性日曬傷、慢性光化性皮炎、日光性角化病、多形性日光疹、光老化、皮膚腫瘤等光線性皮膚病。值得關(guān)注的是,隨著全球臭氧層嚴(yán)重破壞、UV輻射量增加、人類(lèi)生活方式的改變,UV引起的光線性皮膚病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì),成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題。UV誘導(dǎo)皮膚急性光損傷發(fā)生的機(jī)制復(fù)雜,尚未完全闡明,目前國(guó)內(nèi)外對(duì)急性光損傷機(jī)制的研究主要集中在細(xì)胞凋亡、脂質(zhì)蛋白質(zhì)作用、DNA損傷及修復(fù)、氧化應(yīng)激等方面。大量研究證明UV導(dǎo)致氧化應(yīng)激在皮膚急性光損傷的發(fā)生中起了關(guān)鍵性作用。而UV誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的超氧陰離子(O2·-)、過(guò)氧化氫(H_2O_2)、羥自由基(·OH)、單線態(tài)氧(O2)、一氧化氮(NO)等活性氧族(Reactive oxygen species,ROS)是誘發(fā)氧化應(yīng)激損傷的重要環(huán)節(jié)。而且ROS參與了腫瘤、神經(jīng)性病變、高血壓、糖尿病及心血管等疾病的發(fā)生。因此,研究抗氧化應(yīng)激通路變得迫在眉睫。迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的抗氧化應(yīng)激通路為核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid 2-relatedfactor 2,Nrf2)信號(hào)通路。當(dāng)UV輻射產(chǎn)生過(guò)量的ROS時(shí),存在于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子BTB-CNC異體同源體-1(BTB CNC homology 1,Bach1)和Maf識(shí)別元件(Maf recognition elements,MAREs)解離,出核并降解。此時(shí),位于細(xì)胞質(zhì)中Nrf2與其負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(Kelch-like-Ech-associated㧟protein 1,Keap1)解耦聯(lián),入細(xì)胞核,與MAREs結(jié)合形成異二聚體后識(shí)別并結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant response element,ARE),調(diào)控下游II相解毒酶、抗氧化物酶及抗炎癥蛋白等表達(dá),如血紅素加氧酶(Heme oxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、醌氧化還原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase l,NQO1)、環(huán)氧化物水解酶及乙醛還原酶等;清除ROS,減輕氧化應(yīng)激損傷,維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)與功能。故尋找天然的UV防護(hù)劑,激活Nrf2通路,拮抗UV對(duì)皮膚的損傷成為國(guó)內(nèi)外研究的新趨勢(shì)。近年研究發(fā)現(xiàn),從我國(guó)傳統(tǒng)中藥枸杞果實(shí)中提取出的枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)具有抗氧化、抗輻射、抗老化等功能,但對(duì)枸杞多糖能否通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2通路,發(fā)揮強(qiáng)大的抗氧化活性,防護(hù)UV致急性光損傷尚不清楚。因此,本研究探討枸杞多糖對(duì)UV致人皮膚成纖維細(xì)胞(Human skin fibroblasts,HSF)急性光損傷的防護(hù)作用,及對(duì)Nrf2信號(hào)通路的調(diào)控作用,為新型抗皮膚光損傷產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)�！灸康摹�1.探討枸杞多糖是否具有防護(hù)UVA/UVB致HSF細(xì)胞急性光損傷的作用。2.探討枸杞多糖對(duì)UVA/UVB致HSF細(xì)胞急性光損傷可能防護(hù)的機(jī)制。3.探討枸杞多糖對(duì)Nrf2信號(hào)通路的調(diào)控作用,進(jìn)一步闡明枸杞多糖防護(hù)光損傷作用的機(jī)制�！痉椒ā�1.采用不同濃度枸杞多糖(100μg/m1、200μg/m1、300μg/m1、400μg/m1、500μg/m1、600μg/m1、1000μg/m1、1500μg/m1、2000μg/m1)孵育體外培養(yǎng)的HSF細(xì)胞,用倒置光學(xué)顯微鏡及MTT法檢測(cè)每組細(xì)胞形態(tài)變化及增殖情況,篩選出適宜、無(wú)毒性的藥物濃度。2.采用分光光度計(jì)測(cè)定枸杞多糖對(duì)UVA及UVB的吸收情況。3.采用篩選出的適宜濃度的枸杞多糖處理HSF細(xì)胞,24 h后再分別行UVA(25J/cm~2)和UVB(300 mJ/cm~2)照射,MTT法檢測(cè)HSF細(xì)胞增殖活性;DCFH-DA熒光探針檢測(cè)HSF細(xì)胞內(nèi)ROS水平;采用尼羅紅熒光染色法檢測(cè)過(guò)氧化脂質(zhì)水平;彗星實(shí)驗(yàn)察看彗星電泳圖、DNA遷移效應(yīng);酶生化法檢測(cè)HSF細(xì)胞質(zhì)中乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量、SOD和GSH-Px的活性。4.采用qRT-PCR檢測(cè)枸杞多糖干預(yù)后HSF細(xì)胞內(nèi)nrf2 mRNA、bach1 mRNA及下游II相解毒酶sod、cat、nqo1、gclc、gclm mRNA基因的表達(dá);Westernblotting檢測(cè)Nrf2蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及分布變化。5.設(shè)計(jì)并構(gòu)建Nrf2的干擾短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA),通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到HSF細(xì)胞,篩選Nrf2表達(dá)下降的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞--Nrf2~(KD) HSF細(xì)胞。6.分別采用MTT法、DCFH-DA熒光探針、尼羅紅熒光染色法及酶生化法檢測(cè)LBP對(duì)UV致Nrf2~KDD HSF細(xì)胞的增殖活性、ROS水平、過(guò)氧化脂質(zhì)水平和SOD、GSH-Px活性的影響�！窘Y(jié)果】1.不同濃度枸杞多糖(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml)處理HSF細(xì)胞后,倒置光學(xué)顯微鏡下察看各組HSF細(xì)胞狀態(tài)無(wú)顯著差別,MTT結(jié)果顯示:當(dāng)枸杞多糖濃度≤300μg/ml時(shí),HSF細(xì)胞的增殖活性不受影響(P0.05),當(dāng)濃度300μg/ml時(shí),枸杞多糖可抑制HSF細(xì)胞增殖能力(P0.05);故篩選300μg/ml的枸杞多糖用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.濃度為300μg/ml枸杞多糖在280-400 nm UV波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光值均0.3。3.采用含300μg/ml的枸杞多糖培養(yǎng)基孵育HSF細(xì)胞,分別行UVA/UVB照射,MTT結(jié)果顯示:和空白組比較,單純UV輻射顯著抑制HSF細(xì)胞增殖活性(P0.05);與UVA組和UVB組比較,光照前給予枸杞多糖處理組增殖活性增加(P0.05)。與UV組比較,枸杞多糖預(yù)處理組LDH釋放量、ROS水平、過(guò)氧化脂質(zhì)含量均顯著降低(均P0.05),細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性明顯升高(均P0.05)。彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與UV組相比,照光前予枸杞多糖處理組的DNA熒光強(qiáng)度減弱,尾長(zhǎng)縮短,DNA損傷程度明顯減輕。4.枸杞多糖處理HSF細(xì)胞后,qRT-PCR結(jié)果顯示,與空白組相比,300μg/ml枸杞多糖組nrf2 mRNA表達(dá)顯著增加,bach1 mRNA表達(dá)降低。同時(shí)Nrf2下游II相解毒酶基因如sod,cat,nqo1,gclc,gclm mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)(均P0.05)。Western Blot結(jié)果顯示,300μg/ml枸杞多糖組Nrf2核蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于100μg/ml枸杞多糖組及600μg/ml枸杞多糖組(均P0.05)。5.采用慢病毒包裝體系,使得Nrf2核酸及蛋白表達(dá)量水平抑制率均達(dá)70%以上,成功構(gòu)建Nrf2~KDD HSF穩(wěn)定細(xì)胞株。6.UV照射致Nrf2~KDD HSF細(xì)胞組的增殖活性、SOD、GSH-Px活力明顯下降,ROS、過(guò)氧化脂質(zhì)含量顯著升高,相比正常HSF組細(xì)胞,枸杞多糖保護(hù)作用明顯減弱或喪失了UV對(duì)細(xì)胞致光損傷的防護(hù)作用(均P0.05)�！窘Y(jié)論】1.枸杞多糖對(duì)UVA/UVB致HSF細(xì)胞的急性光損傷具有防護(hù)作用。2.枸杞多糖防護(hù)急性光損傷的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控Nrf2信號(hào)通路,誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位,上調(diào)Nrf2、下游II相解毒酶及抗氧化酶基因的表達(dá),清除UV照射產(chǎn)生的過(guò)量ROS,抑制脂質(zhì)過(guò)氧化,減輕DNA鏈斷裂損傷,增強(qiáng)細(xì)胞活性,從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激損傷。
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285
【圖文】：

將酶切位點(diǎn)換成pLVX-shRNA2 的 BamHI 和 EcoRI，然后再加一個(gè)鑒定用的酶切位點(diǎn) MluI。如圖2-1 所示，箭頭所指即為酶切位點(diǎn)。圖 2-1 干擾位點(diǎn)示意圖具體位點(diǎn)設(shè)計(jì)如下：5’-GATCCGGGAGGAGCTATTATCCATTCTTCAAGAGAGAATGGATAATAGCTCCTCCCTTTTTTACGCGTG-3’3’-GCCCTCCTCGATAATAGGTAAGAAGTTCTCTCTTACCTATTATCGAGGAGGGAAAAAATGCGCACTTAA-5’(2) 載體的構(gòu)建用去離子水將每條 oligo 均稀釋到 50 μM，各取成對(duì)的 oligo 4.5 μl，再加入 1μl 10X PCRbuffer，于 95℃ 、3 min，待降至室溫。將 pLVX-shRNA2 質(zhì)粒用 BamHI和 EcoRI 雙酶切，盡量保證載體被所有的雙酶切開(kāi)。然后取 1 μl 退火后的溶液，與載體連接并轉(zhuǎn)化。進(jìn)行質(zhì)粒的提取和驗(yàn)證時(shí)，抽提質(zhì)粒需用 MluI 單酶切

廣州醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文第三部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 HSF 細(xì)胞增殖活性的影響示，當(dāng)枸杞多糖的濃度 ≤ 300 μg/ml 時(shí)，其對(duì) HSF 細(xì)均 P > 0.05）；當(dāng)濃度為 300 -2000 μg/ml 時(shí)，枸杞多性（均 P < 0.05）。故選取 300 μg/ml 枸杞多糖用于

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1 胡志斌;李U喢

本文編號(hào)：2731021