【摘要】：【研究背景】太陽輻射包含紫外線(Ultraviolet,UV)、可見光及紅外線。而UV輻射是最具有生物學效應的部分,對人類的健康及疾病有著最大的影響。陽光中的UV根據(jù)生物學作用差異分為三類:長波紫外線(Ultraviolet A,UVA,320㧟400 nm)、中波紫外線(Ultraviolet B,UVB,280㧟320 nm)、短波紫外線(Ultraviolet C,UVC,200㧟280 nm)。由于臭氧層的折射、散射作用,大部分UVB、幾乎全部UVC均被吸收,無法到達地球表面。所以生活在地球表面的人類主要受UVA及少量UVB的輻射。皮膚作為我們人體最大的器官,是抵御外界機械、生物、化學、物理等各種刺激的第一道防線。UV是造成皮膚損傷、破壞皮膚屏障的關鍵性因素;長期、累積或大劑量UV照射可以導致急性日曬傷、慢性光化性皮炎、日光性角化病、多形性日光疹、光老化、皮膚腫瘤等光線性皮膚病。值得關注的是,隨著全球臭氧層嚴重破壞、UV輻射量增加、人類生活方式的改變,UV引起的光線性皮膚病的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢,成為全球關注的熱點問題。UV誘導皮膚急性光損傷發(fā)生的機制復雜,尚未完全闡明,目前國內外對急性光損傷機制的研究主要集中在細胞凋亡、脂質蛋白質作用、DNA損傷及修復、氧化應激等方面。大量研究證明UV導致氧化應激在皮膚急性光損傷的發(fā)生中起了關鍵性作用。而UV誘導細胞產生過量的超氧陰離子(O2·-)、過氧化氫(H_2O_2)、羥自由基(·OH)、單線態(tài)氧(O2)、一氧化氮(NO)等活性氧族(Reactive oxygen species,ROS)是誘發(fā)氧化應激損傷的重要環(huán)節(jié)。而且ROS參與了腫瘤、神經(jīng)性病變、高血壓、糖尿病及心血管等疾病的發(fā)生。因此,研究抗氧化應激通路變得迫在眉睫。迄今為止發(fā)現(xiàn)的最重要的抗氧化應激通路為核因子E2相關因子2(Nuclear factor erythroid 2-relatedfactor 2,Nrf2)信號通路。當UV輻射產生過量的ROS時,存在于細胞核內的轉錄因子BTB-CNC異體同源體-1(BTB CNC homology 1,Bach1)和Maf識別元件(Maf recognition elements,MAREs)解離,出核并降解。此時,位于細胞質中Nrf2與其負向調節(jié)蛋白Kelch樣ECH聯(lián)合蛋白1(Kelch-like-Ech-associated㧟protein 1,Keap1)解耦聯(lián),入細胞核,與MAREs結合形成異二聚體后識別并結合抗氧化反應元件(Antioxidant response element,ARE),調控下游II相解毒酶、抗氧化物酶及抗炎癥蛋白等表達,如血紅素加氧酶(Heme oxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、醌氧化還原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase l,NQO1)、環(huán)氧化物水解酶及乙醛還原酶等;清除ROS,減輕氧化應激損傷,維持細胞正常結構與功能。故尋找天然的UV防護劑,激活Nrf2通路,拮抗UV對皮膚的損傷成為國內外研究的新趨勢。近年研究發(fā)現(xiàn),從我國傳統(tǒng)中藥枸杞果實中提取出的枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)具有抗氧化、抗輻射、抗老化等功能,但對枸杞多糖能否通過調節(jié)Nrf2通路,發(fā)揮強大的抗氧化活性,防護UV致急性光損傷尚不清楚。因此,本研究探討枸杞多糖對UV致人皮膚成纖維細胞(Human skin fibroblasts,HSF)急性光損傷的防護作用,及對Nrf2信號通路的調控作用,為新型抗皮膚光損傷產品開發(fā)提供科學依據(jù)。【目的】1.探討枸杞多糖是否具有防護UVA/UVB致HSF細胞急性光損傷的作用。2.探討枸杞多糖對UVA/UVB致HSF細胞急性光損傷可能防護的機制。3.探討枸杞多糖對Nrf2信號通路的調控作用,進一步闡明枸杞多糖防護光損傷作用的機制。【方法】1.采用不同濃度枸杞多糖(100μg/m1、200μg/m1、300μg/m1、400μg/m1、500μg/m1、600μg/m1、1000μg/m1、1500μg/m1、2000μg/m1)孵育體外培養(yǎng)的HSF細胞,用倒置光學顯微鏡及MTT法檢測每組細胞形態(tài)變化及增殖情況,篩選出適宜、無毒性的藥物濃度。2.采用分光光度計測定枸杞多糖對UVA及UVB的吸收情況。3.采用篩選出的適宜濃度的枸杞多糖處理HSF細胞,24 h后再分別行UVA(25J/cm~2)和UVB(300 mJ/cm~2)照射,MTT法檢測HSF細胞增殖活性;DCFH-DA熒光探針檢測HSF細胞內ROS水平;采用尼羅紅熒光染色法檢測過氧化脂質水平;彗星實驗察看彗星電泳圖、DNA遷移效應;酶生化法檢測HSF細胞質中乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量、SOD和GSH-Px的活性。4.采用qRT-PCR檢測枸杞多糖干預后HSF細胞內nrf2 mRNA、bach1 mRNA及下游II相解毒酶sod、cat、nqo1、gclc、gclm mRNA基因的表達;Westernblotting檢測Nrf2蛋白在細胞內表達及分布變化。5.設計并構建Nrf2的干擾短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA),通過慢病毒轉導到HSF細胞,篩選Nrf2表達下降的穩(wěn)轉細胞--Nrf2~(KD) HSF細胞。6.分別采用MTT法、DCFH-DA熒光探針、尼羅紅熒光染色法及酶生化法檢測LBP對UV致Nrf2~KDD HSF細胞的增殖活性、ROS水平、過氧化脂質水平和SOD、GSH-Px活性的影響。【結果】1.不同濃度枸杞多糖(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml)處理HSF細胞后,倒置光學顯微鏡下察看各組HSF細胞狀態(tài)無顯著差別,MTT結果顯示:當枸杞多糖濃度≤300μg/ml時,HSF細胞的增殖活性不受影響(P0.05),當濃度300μg/ml時,枸杞多糖可抑制HSF細胞增殖能力(P0.05);故篩選300μg/ml的枸杞多糖用于后續(xù)實驗。2.濃度為300μg/ml枸杞多糖在280-400 nm UV波長范圍內的吸光值均0.3。3.采用含300μg/ml的枸杞多糖培養(yǎng)基孵育HSF細胞,分別行UVA/UVB照射,MTT結果顯示:和空白組比較,單純UV輻射顯著抑制HSF細胞增殖活性(P0.05);與UVA組和UVB組比較,光照前給予枸杞多糖處理組增殖活性增加(P0.05)。與UV組比較,枸杞多糖預處理組LDH釋放量、ROS水平、過氧化脂質含量均顯著降低(均P0.05),細胞內SOD、GSH-Px活性明顯升高(均P0.05)。彗星實驗結果顯示:與UV組相比,照光前予枸杞多糖處理組的DNA熒光強度減弱,尾長縮短,DNA損傷程度明顯減輕。4.枸杞多糖處理HSF細胞后,qRT-PCR結果顯示,與空白組相比,300μg/ml枸杞多糖組nrf2 mRNA表達顯著增加,bach1 mRNA表達降低。同時Nrf2下游II相解毒酶基因如sod,cat,nqo1,gclc,gclm mRNA的表達均明顯上調(均P0.05)。Western Blot結果顯示,300μg/ml枸杞多糖組Nrf2核蛋白的相對表達量顯著高于100μg/ml枸杞多糖組及600μg/ml枸杞多糖組(均P0.05)。5.采用慢病毒包裝體系,使得Nrf2核酸及蛋白表達量水平抑制率均達70%以上,成功構建Nrf2~KDD HSF穩(wěn)定細胞株。6.UV照射致Nrf2~KDD HSF細胞組的增殖活性、SOD、GSH-Px活力明顯下降,ROS、過氧化脂質含量顯著升高,相比正常HSF組細胞,枸杞多糖保護作用明顯減弱或喪失了UV對細胞致光損傷的防護作用(均P0.05)。【結論】1.枸杞多糖對UVA/UVB致HSF細胞的急性光損傷具有防護作用。2.枸杞多糖防護急性光損傷的機制可能是通過調控Nrf2信號通路,誘導Nrf2核轉位,上調Nrf2、下游II相解毒酶及抗氧化酶基因的表達,清除UV照射產生的過量ROS,抑制脂質過氧化,減輕DNA鏈斷裂損傷,增強細胞活性,從而發(fā)揮抗氧化應激損傷。
【學位授予單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

將酶切位點換成pLVX-shRNA2 的 BamHI 和 EcoRI，然后再加一個鑒定用的酶切位點 MluI。如圖2-1 所示，箭頭所指即為酶切位點。圖 2-1 干擾位點示意圖具體位點設計如下：5’-GATCCGGGAGGAGCTATTATCCATTCTTCAAGAGAGAATGGATAATAGCTCCTCCCTTTTTTACGCGTG-3’3’-GCCCTCCTCGATAATAGGTAAGAAGTTCTCTCTTACCTATTATCGAGGAGGGAAAAAATGCGCACTTAA-5’(2) 載體的構建用去離子水將每條 oligo 均稀釋到 50 μM，各取成對的 oligo 4.5 μl，再加入 1μl 10X PCRbuffer，于 95℃ 、3 min，待降至室溫。將 pLVX-shRNA2 質粒用 BamHI和 EcoRI 雙酶切，盡量保證載體被所有的雙酶切開。然后取 1 μl 退火后的溶液，與載體連接并轉化。進行質粒的提取和驗證時，抽提質粒需用 MluI 單酶切

廣州醫(yī)科大學碩士學位論文第三部分 實驗結果 HSF 細胞增殖活性的影響示，當枸杞多糖的濃度 ≤ 300 μg/ml 時，其對 HSF 細均 P > 0.05）；當濃度為 300 -2000 μg/ml 時，枸杞多性（均 P < 0.05）。故選取 300 μg/ml 枸杞多糖用于

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本文編號：2731021