【摘要】：背景:癌癥嚴重影響人類的身心健康,其發(fā)生發(fā)展是多因素長期作用的結果。而慢性炎癥則是其中的重要因素之一。1863年,Rudolf Virchow發(fā)現腫瘤組織中存在一定量白細胞,由此將炎癥與腫瘤聯(lián)系起來,并提出炎癥是腫瘤發(fā)生的原因。胃癌(GC)是全球第四常見的惡性腫瘤,同時GC引起的腫瘤性死亡在全世界腫瘤性死亡排第二。我國胃癌患者基數大,因此對于胃癌的治療任重道遠。胃癌與慢性胃炎關系密切,因此,我們是否可以通過應用免疫調節(jié)藥物,調節(jié)胃癌炎性微環(huán)境是我們工作的重點。人參皂苷Rg3是人參的提取物之一,具有抗腫瘤活性。目前關于人參皂苷Rg3的抗腫瘤機制研究,大多數集中于其促腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞增殖及阻滯細胞周期等作用上,有文獻報道,人參皂苷Rg3可調節(jié)樹突狀細胞(DC)活性,在此基礎上,我們考慮人參皂苷Rg3具有免疫調節(jié)的潛能。有文獻報道,人參皂苷Rg3干預腫瘤細胞后,上清中IFN-γ表達升高,IL-4表達下降,而IFN-γ、IL-4與巨噬細胞的極化密切相關,同時,我們前期工作已經發(fā)現人參皂苷Rg3可以抑制腫瘤新生血管形成,已有大量研究表明腫瘤組織中的血管形成與TME中的TAM密切相關,故提出假說,人參皂苷Rg3可能通過調節(jié)巨噬細胞極化從而發(fā)揮其抗腫瘤功效。我們以巨噬細胞作為研究對象,通過TAM與胃癌細胞株MFC共培養(yǎng)體外模擬胃癌炎性微環(huán)境,觀察人參皂苷Rg3對巨噬細胞極化的影響;利用胃癌腹腔轉移瘤小鼠模型,探究人參皂苷Rg3能否通過其免疫調節(jié)作用改變胃癌炎性微環(huán)境,達到抑制腫瘤發(fā)展的目的。目的:1、確定人參皂苷Rg3對MFC細胞活力的直接影響。2、觀察人參皂苷Rg3能否誘導巨噬細胞向M1極化。3、動物試驗觀察人參皂苷Rg3在體內抗腫瘤活性及對腫瘤組織中巨噬細胞極化的影響。方法:1、CCK-8實驗:培養(yǎng)MFC細胞,接種96孔板,用以下濃度人參皂苷Rg3干預MFC細胞:25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。分別于干預24、48h后用CCK8試劑檢測細胞活性。2、用條件培養(yǎng)液體外模擬胃癌微環(huán)境:用0μg/ml、25μg/m、50μg/ml、100μg/ml的人參皂苷Rg3溶液處理MFC細胞,48h后棄上清,更換為無血清DMEM細胞培養(yǎng)液,24h后收集各孔上清培養(yǎng)液并加入預先培養(yǎng)好的小鼠巨噬細胞RAW264.7中,再分別收集RAW264.7細胞和上清,細胞提取RNA和蛋白,RNA用于RT-PCR實驗,檢測RAW264.7細胞中iNOS、IL-12、IL-10的表達量;用Western blot法檢測iNOS、IL-12、Arg-1蛋白的表達水平。3、建立615小鼠腹腔轉移瘤模型:選擇合適的腹腔灌注細胞數后,予以荷瘤,設立control組(空白組)、Rg3組、5Fu組、Rg3+5Fu組(聯(lián)合組),在腹腔轉移瘤模型建立成功后,給與相應藥物干預,觀察小鼠生存時間,取小鼠眼眶血、腹腔積液做后續(xù)ELISA實驗,取腹腔腫瘤標本做免疫組化。結果:1、人參皂苷Rg3干預MFC細胞后,細胞活力降低,Rg3濃度越高,細胞活力越低。2、RT-PCR實驗表明,不同濃度人參皂苷Rg3作用MFC細胞所得條件培養(yǎng)液處理RAW264.7細胞后,MFC CM(未用藥物干預的條件培養(yǎng)基)處理組同IL-4處理組iNOS、IL-12、IL-10表達量相仿;其余組RAW264.7細胞的iNOS、IL-12表達量隨著人參皂苷Rg3濃度的增加也逐步增加;而IL-10的表達隨著人參皂苷Rg3濃度的增加逐漸降低。Western blot實驗提示,不同濃度人參皂苷Rg3作用MFC細胞所得條件培養(yǎng)液處理RAW264.7細胞后,隨著人參皂苷Rg3濃度的增加,所得到的條件培養(yǎng)液處理RAW264.7細胞后,其iNOS和IL12的表達呈上升趨勢,而Arg1表達則呈下降趨勢。3、Rg3組與control組相比較,兩組腫瘤組織中CD68陽性比例接近,而Rg3組CD11c陽性比例明顯增高、CD206的陽性比例明顯降低;將聯(lián)合組同5Fu組進行對比,可見兩組腫瘤組織中CD68陽性比例接近,聯(lián)合組CD11c陽性比例明顯增高、而CD206的陽性比例明顯降低;將5-Fu同control組對比,二者CD68、CD11c、CD206陽性比例均相仿。提示人參皂苷可誘導TME巨噬細胞向M1型巨噬細胞發(fā)生極化,抑制巨噬細胞極化為M2型巨噬細胞。Rg3可延長小鼠生存時間,但其效果不如5Fu,聯(lián)合治療具有協(xié)同作用,可進一步延長小鼠生存時間。結論:人參皂苷Rg3在體外可抑制MFC細胞增殖,且具有劑量依賴性,體內具有抗腫瘤活性。細胞實驗及動物實驗均提示其機制可能與Rg3誘導巨噬細胞向M1極化,改善胃癌炎性微環(huán)境相關。
【學位授予單位】：中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

實驗結果一、CCK-8實驗結果圖1 不同濃度人參皂苷Rg3作用下MFC細胞活力（n=3）圖1中不同濃度Rg3處理組分別與空白對照組進行兩兩對比，可以看出不同濃度Rg3作用MFC細胞后，MFC細胞活力均下降。同時我們可以看出在作用相同時間的條件下，隨著人參皂苷Rg3濃度的不斷增加，MFC細胞活力逐漸下降。由此提示，人 參 皂 苷 Rg3 對 MFC 細 胞 活 性 的 影 響 具 有 劑 量 依 賴 性 。 (*p<0.05 ， **p<0.01,***p<0.001)。二、RT-PCR實驗圖2 IL-4及各條件培

圖1 不同濃度人參皂苷Rg3作用下MFC細胞活力（n=3）圖1中不同濃度Rg3處理組分別與空白對照組進行兩兩對比，可以看出不同濃度Rg3作用MFC細胞后，MFC細胞活力均下降。同時我們可以看出在作用相同時間的條件下，隨著人參皂苷Rg3濃度的不斷增加，MFC細胞活力逐漸下降。由此提示，人 參 皂 苷 Rg3 對 MFC 細 胞 活 性 的 影 響 具 有 劑 量 依 賴 性 。 (*p<0.05 ， **p<0.01,***p<0.001)。二、RT-PCR實驗

【參考文獻】

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