【摘要】：背景:癌癥嚴(yán)重影響人類的身心健康,其發(fā)生發(fā)展是多因素長(zhǎng)期作用的結(jié)果。而慢性炎癥則是其中的重要因素之一。1863年,Rudolf Virchow發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中存在一定量白細(xì)胞,由此將炎癥與腫瘤聯(lián)系起來(lái),并提出炎癥是腫瘤發(fā)生的原因。胃癌(GC)是全球第四常見(jiàn)的惡性腫瘤,同時(shí)GC引起的腫瘤性死亡在全世界腫瘤性死亡排第二。我國(guó)胃癌患者基數(shù)大,因此對(duì)于胃癌的治療任重道遠(yuǎn)。胃癌與慢性胃炎關(guān)系密切,因此,我們是否可以通過(guò)應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)藥物,調(diào)節(jié)胃癌炎性微環(huán)境是我們工作的重點(diǎn)。人參皂苷Rg3是人參的提取物之一,具有抗腫瘤活性。目前關(guān)于人參皂苷Rg3的抗腫瘤機(jī)制研究,大多數(shù)集中于其促腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤細(xì)胞增殖及阻滯細(xì)胞周期等作用上,有文獻(xiàn)報(bào)道,人參皂苷Rg3可調(diào)節(jié)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)活性,在此基礎(chǔ)上,我們考慮人參皂苷Rg3具有免疫調(diào)節(jié)的潛能。有文獻(xiàn)報(bào)道,人參皂苷Rg3干預(yù)腫瘤細(xì)胞后,上清中IFN-γ表達(dá)升高,IL-4表達(dá)下降,而IFN-γ、IL-4與巨噬細(xì)胞的極化密切相關(guān),同時(shí),我們前期工作已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3可以抑制腫瘤新生血管形成,已有大量研究表明腫瘤組織中的血管形成與TME中的TAM密切相關(guān),故提出假說(shuō),人參皂苷Rg3可能通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化從而發(fā)揮其抗腫瘤功效。我們以巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象,通過(guò)TAM與胃癌細(xì)胞株MFC共培養(yǎng)體外模擬胃癌炎性微環(huán)境,觀察人參皂苷Rg3對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響;利用胃癌腹腔轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型,探究人參皂苷Rg3能否通過(guò)其免疫調(diào)節(jié)作用改變胃癌炎性微環(huán)境,達(dá)到抑制腫瘤發(fā)展的目的。目的:1、確定人參皂苷Rg3對(duì)MFC細(xì)胞活力的直接影響。2、觀察人參皂苷Rg3能否誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1極化。3、動(dòng)物試驗(yàn)觀察人參皂苷Rg3在體內(nèi)抗腫瘤活性及對(duì)腫瘤組織中巨噬細(xì)胞極化的影響。方法:1、CCK-8實(shí)驗(yàn):培養(yǎng)MFC細(xì)胞,接種96孔板,用以下濃度人參皂苷Rg3干預(yù)MFC細(xì)胞:25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml。分別于干預(yù)24、48h后用CCK8試劑檢測(cè)細(xì)胞活性。2、用條件培養(yǎng)液體外模擬胃癌微環(huán)境:用0μg/ml、25μg/m、50μg/ml、100μg/ml的人參皂苷Rg3溶液處理MFC細(xì)胞,48h后棄上清,更換為無(wú)血清DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,24h后收集各孔上清培養(yǎng)液并加入預(yù)先培養(yǎng)好的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中,再分別收集RAW264.7細(xì)胞和上清,細(xì)胞提取RNA和蛋白,RNA用于RT-PCR實(shí)驗(yàn),檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中iNOS、IL-12、IL-10的表達(dá)量;用Western blot法檢測(cè)iNOS、IL-12、Arg-1蛋白的表達(dá)水平。3、建立615小鼠腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型:選擇合適的腹腔灌注細(xì)胞數(shù)后,予以荷瘤,設(shè)立control組(空白組)、Rg3組、5Fu組、Rg3+5Fu組(聯(lián)合組),在腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型建立成功后,給與相應(yīng)藥物干預(yù),觀察小鼠生存時(shí)間,取小鼠眼眶血、腹腔積液做后續(xù)ELISA實(shí)驗(yàn),取腹腔腫瘤標(biāo)本做免疫組化。結(jié)果:1、人參皂苷Rg3干預(yù)MFC細(xì)胞后,細(xì)胞活力降低,Rg3濃度越高,細(xì)胞活力越低。2、RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明,不同濃度人參皂苷Rg3作用MFC細(xì)胞所得條件培養(yǎng)液處理RAW264.7細(xì)胞后,MFC CM(未用藥物干預(yù)的條件培養(yǎng)基)處理組同IL-4處理組iNOS、IL-12、IL-10表達(dá)量相仿;其余組RAW264.7細(xì)胞的iNOS、IL-12表達(dá)量隨著人參皂苷Rg3濃度的增加也逐步增加;而IL-10的表達(dá)隨著人參皂苷Rg3濃度的增加逐漸降低。Western blot實(shí)驗(yàn)提示,不同濃度人參皂苷Rg3作用MFC細(xì)胞所得條件培養(yǎng)液處理RAW264.7細(xì)胞后,隨著人參皂苷Rg3濃度的增加,所得到的條件培養(yǎng)液處理RAW264.7細(xì)胞后,其iNOS和IL12的表達(dá)呈上升趨勢(shì),而Arg1表達(dá)則呈下降趨勢(shì)。3、Rg3組與control組相比較,兩組腫瘤組織中CD68陽(yáng)性比例接近,而Rg3組CD11c陽(yáng)性比例明顯增高、CD206的陽(yáng)性比例明顯降低;將聯(lián)合組同5Fu組進(jìn)行對(duì)比,可見(jiàn)兩組腫瘤組織中CD68陽(yáng)性比例接近,聯(lián)合組CD11c陽(yáng)性比例明顯增高、而CD206的陽(yáng)性比例明顯降低;將5-Fu同control組對(duì)比,二者CD68、CD11c、CD206陽(yáng)性比例均相仿。提示人參皂苷可誘導(dǎo)TME巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞發(fā)生極化,抑制巨噬細(xì)胞極化為M2型巨噬細(xì)胞。Rg3可延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間,但其效果不如5Fu,聯(lián)合治療具有協(xié)同作用,可進(jìn)一步延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間。結(jié)論:人參皂苷Rg3在體外可抑制MFC細(xì)胞增殖,且具有劑量依賴性,體內(nèi)具有抗腫瘤活性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均提示其機(jī)制可能與Rg3誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M1極化,改善胃癌炎性微環(huán)境相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果一、CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖1 不同濃度人參皂苷Rg3作用下MFC細(xì)胞活力（n=3）圖1中不同濃度Rg3處理組分別與空白對(duì)照組進(jìn)行兩兩對(duì)比，可以看出不同濃度Rg3作用MFC細(xì)胞后，MFC細(xì)胞活力均下降。同時(shí)我們可以看出在作用相同時(shí)間的條件下，隨著人參皂苷Rg3濃度的不斷增加，MFC細(xì)胞活力逐漸下降。由此提示，人 參 皂 苷 Rg3 對(duì) MFC 細(xì) 胞 活 性 的 影 響 具 有 劑 量 依 賴 性 。 (*p<0.05 ， **p<0.01,***p<0.001)。二、RT-PCR實(shí)驗(yàn)圖2 IL-4及各條件培

圖1 不同濃度人參皂苷Rg3作用下MFC細(xì)胞活力（n=3）圖1中不同濃度Rg3處理組分別與空白對(duì)照組進(jìn)行兩兩對(duì)比，可以看出不同濃度Rg3作用MFC細(xì)胞后，MFC細(xì)胞活力均下降。同時(shí)我們可以看出在作用相同時(shí)間的條件下，隨著人參皂苷Rg3濃度的不斷增加，MFC細(xì)胞活力逐漸下降。由此提示，人 參 皂 苷 Rg3 對(duì) MFC 細(xì) 胞 活 性 的 影 響 具 有 劑 量 依 賴 性 。 (*p<0.05 ， **p<0.01,***p<0.001)。二、RT-PCR實(shí)驗(yàn)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2728464