【摘要】：目的:探討淫羊藿苷(Icariin,ICA)對(duì)脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并明確核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid-2related factor 2,Nrf2)信號(hào)通路在其中所發(fā)揮的作用。方法:(1)將BV2細(xì)胞(小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞株)隨機(jī)分為空白組、ICA(0.1μM)單獨(dú)給藥組、LPS(1μg/ml)組、LPS+ICA(0.01μM)低劑量組、LPS+ICA(0.1μM)高劑量組。細(xì)胞給予ICA作用30 min后再給予LPS處理24 h。通過(guò)MTT法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞的損傷情況;免疫熒光觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況和Nrf2的激活情況;通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)2 h、6 h、24 h時(shí)Nrf2、HO-1和NQO1的m RNA水平;通過(guò)Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中Iba-1、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá);通過(guò)Griess法和ELISA法分別檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-18的含量。(2)為了確定Nrf2信號(hào)通路在ICA抗神經(jīng)炎癥中發(fā)揮的作用,分別通過(guò)Nrf2-siRNA(50 n M)沉默Nrf2表達(dá)和HO-1特異性抑制劑Zn PP(20μM)抑制HO-1表達(dá),用Western Blot分別檢測(cè)Nrf2的沉默效率和HO-1的抑制效率;通過(guò)免疫熒光觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況;通過(guò)Real-time PCR分別檢測(cè)2 h、6 h、24 h時(shí)Nrf2、HO-1和NQO1的m RNA水平,Western Blot檢測(cè)Iba-1、Nrf2、HO-1和NQO1表達(dá);通過(guò)Griess試劑盒和ELISA法分別檢測(cè)上清液中NO、IL-1β和IL-18的含量。結(jié)果:(1)MTT結(jié)果顯示,空白組、ICA(0.1μM)單獨(dú)給藥組、LPS(1μg/ml)組、LPS+ICA(0.01μM)低劑量組和LPS+ICA(0.1μM)高劑量組之間細(xì)胞活力無(wú)明顯變化;Western Blot和免疫熒光結(jié)果顯示,ICA可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活;Griess試劑盒和ELISA法測(cè)得的結(jié)果顯示與空白組相比,LPS組NO,IL-1β和IL-18的釋放量增加,而在給予ICA后明顯降低;PCR結(jié)果顯示LPS可以增加2 h時(shí)Nrf2的m RNA水平和6 h時(shí)HO-1、NQO1的m RNA水平,給予ICA后,相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的Nrf2、HO-1、NQO1的m RNA水平進(jìn)一步增加;免疫熒光結(jié)果顯示與LPS組相比,給予ICA能增加Nrf2的入核;Western Blot結(jié)果顯示LPS組BV2細(xì)胞的細(xì)胞核中Nrf2以及HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)與空白組相比明顯升高,在給予ICA后,細(xì)胞核中Nrf2和細(xì)胞中HO-1、NQO1的蛋白表達(dá)進(jìn)一步升高。(2)Western Blot結(jié)果顯示用Nrf2-si RNA轉(zhuǎn)染后小膠質(zhì)細(xì)胞中的Nrf2蛋白表達(dá)明顯下降;MTT結(jié)果顯示Nrf2-si RNA(50 n M)對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒性;PCR結(jié)果顯示給予Nrf2-si RNA 6 h后HO-1和NQO1的m RNA水平相對(duì)于LPS+ICA(0.1μM)明顯降低;Western Blot結(jié)果顯示Nrf2-si RNA處理后HO-1和NQO1的蛋白表達(dá)相對(duì)于LPS+ICA(0.1μM)明顯降低;免疫熒光結(jié)果顯示在給予Nrf2-si RNA后,小膠質(zhì)細(xì)胞的激活量相對(duì)于LPS+ICA(0.1μM)組明顯升高。用Griess法和ELISA測(cè)得的結(jié)果顯示用Nrf2-si RNA處理后,培養(yǎng)基中NO、IL-1β和IL-18的釋放量相對(duì)于LPS+ICA(0.1μM)組明顯升高。(3)Western Blot結(jié)果顯示HO-1抑制劑Zn PP(20μM)可降低HO-1蛋白表達(dá);MTT結(jié)果顯示20μM的Zn PP對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的毒性作用;PCR結(jié)果和Western Blot結(jié)果顯示Zn PP對(duì)ICA誘導(dǎo)的Nrf2激活沒(méi)有顯著影響;Western Blot結(jié)果和免疫熒光結(jié)果提示Zn PP處理后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活量相對(duì)于LPS+ICA(0.1μM)明顯升高;Griess試劑盒和ELISA測(cè)得的結(jié)果顯示在給予Zn PP后,炎癥因子的釋放量相對(duì)于LPS+ICA(0.1μM)組明顯升高。結(jié)論:ICA可能通過(guò)調(diào)控Nrf2信號(hào)通路抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

S 介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥反應(yīng)0.01μM）和 ICA（0.1μM）預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞 理 24h。通過(guò) MTT 測(cè)定細(xì)胞活力。如圖 1 所示LPS（1μg/ml）組、LPS+ICA（0.01μM）低劑量細(xì)胞活力無(wú)明顯變化。收集細(xì)胞總蛋白，通過(guò)達(dá)。如圖 2A 和 2B 所示，與 LPS 組相比，給顯降低，說(shuō)明 ICA 可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活。隨培養(yǎng)基中 NO，IL-1β 和 IL-18 的釋放量。如圖 3給予 LPS 后，培養(yǎng)基中 NO，IL-1β 和 IL-18 的明顯下降。

圖 2 ICA 抑制 LPS 介導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞激活注：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤( ± SEM，n=3)表示，*P<0.05 vs 空白組,#P<0.05 vs LPS 組。（A）各組細(xì)胞Iba-1 免疫熒光代表圖片（標(biāo)尺=100 μm）；（B）各組細(xì)胞 Iba-1 代表性條帶和含量統(tǒng)計(jì)圖；Fig. 2 ICAattenuated LPS-induced microglia activation. Results were the mean ± SEM from three independentexperiments performed in triplicate. *P<0.05 compared with the control cultures;#P<0.05 compared with LPS-treatedcultures. (A) Representative photomicrographs of Iba-1 of each group (scale bar = 100 μm); (B) Representative bandsand quantitative analysis of Iba-1 of different groups.圖 3 ICA 抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放注：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤( ± SEM，n=3)表示，*P<0.05 vs 空白組,#P<0.05 vs LPS 組。（A）各組細(xì)胞上清中 NO 的釋放量;（B）各組細(xì)胞上清中 NO、IL-1β、IL-18 的釋放量；（C）各組細(xì)胞上清中 IL-18 的釋放x

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