【摘要】：研究背景肝臟不僅是內(nèi)源性和外源性脂質(zhì)代謝途徑的交匯點,而且是維持體內(nèi)脂質(zhì)合成與分解代謝平衡的重要靶器官。高能量飲食攝取不僅誘發(fā)全身性能量代謝途徑失衡,而且引發(fā)肝臟脂質(zhì)代謝紊亂,最終導(dǎo)致代謝綜合癥如肥胖、2型糖尿病、高脂血癥及非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的發(fā)生。近年來,NAFLD呈全球蔓延趨勢,在我國的發(fā)病率也日益上升,并逐漸呈現(xiàn)低年齡態(tài)勢。臨床NAFLD的病理特征是肝細(xì)胞內(nèi)脂肪異位沉積,若大量脂肪彌漫性浸潤,則會演變?yōu)榉蔷凭灾靖窝?nonalcoholic steatohepatitis,NASH),甚至是肝纖維化或肝硬化。NAFLD的致病基礎(chǔ)是肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的從頭合成途徑(de novo lipogenesis,DNL)逐漸增強,而脂質(zhì)分解及轉(zhuǎn)運途徑相繼減弱,造成甘油三酯大量堆積,從而嚴(yán)重破壞肝細(xì)胞脂代謝平衡。由此可見,肝臟脂質(zhì)代謝失衡是形成脂肪肝的基礎(chǔ)�，F(xiàn)階段,臨床針對NAFLD的治療仍主要采取適度理療、服用降血脂藥物及肝臟保護劑等,但是藥效甚微,無法達(dá)到根本治療NAFLD的目的。因此,加快研發(fā)針對性治療NAFLD的藥物勢在必行。沉默調(diào)節(jié)因子1(sirtuin 1,SIRT1)是一種依賴于NAD+的去乙�；�,研究發(fā)現(xiàn)它不僅參與了細(xì)胞的能量代謝調(diào)節(jié),而且能夠改善骨骼肌胰島素敏感性、肝細(xì)胞內(nèi)的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷。最近報道,SIRT1在NAFLD中發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用。Sirt1+/-小鼠給予正常飲食后,肝臟中甘油三酯合成增加,同時伴隨脂肪異位沉積。而肝臟SIRT1過表達(dá)可以明顯抑制高脂誘導(dǎo)的脂肪肝癥狀。研究發(fā)現(xiàn)SIRT1可以調(diào)節(jié)類固醇類元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element-binding protein 1c,SREBP-1c)和過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)等與脂質(zhì)合成相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子。在肝細(xì)胞中SIRT1對SREBP-1c去乙�；�,可以顯著抑制SREBP-1c下游脂質(zhì)代謝相關(guān)限速酶和自身的轉(zhuǎn)錄活性,從而極大削弱了甘油三酯DNL途徑。在Sirt1-/-小鼠模型中,發(fā)現(xiàn)脂肪細(xì)胞急劇減少,并伴隨PPARγ活性幾乎完全消失。后續(xù)研究者發(fā)現(xiàn),SIRT1還可以去乙�；疨PARγ共輔因子,阻礙脂肪細(xì)胞分化及成熟。除此之外,SIRT1還可以通過激酶如肝激酶B1(liver kinase B1,LKB1)去乙�；饔冒l(fā)揮代謝通路調(diào)控效應(yīng)。研究證實經(jīng)SIRT1去乙�；腖KB1更容易磷酸化AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)。AMPK晝夜節(jié)律的變化依賴于下丘腦的調(diào)節(jié),因此AMPK是一種關(guān)鍵的細(xì)胞能量感受器,其生物活性變化受制于AMP/ATP比值調(diào)節(jié)。已發(fā)現(xiàn),LKB1和Ca2+/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶激酶(calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase,Ca MKK)都可以直接磷酸化AMPK�；罨腁MPK可以直接調(diào)節(jié)脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase,ATGL)和激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase,HSL)的表達(dá),促進脂肪動員。AMPK可以磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-Co A carboxylase,ACC),導(dǎo)致中間產(chǎn)物丙二酰單酰輔酶A(malonyl-Co A)的減少,解除脂肪酸分解酶---肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1α(carnitine palmitoyltransferase-1α,CPT-1α)的抑制,加速脂肪酸氧化與利用。上述報導(dǎo)表明,SIRT1/AMPK通路在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著多樣且重要的作用,為NAFLD藥物篩選和機制討論提供了新的思路�，F(xiàn)代研究證實,中藥枸杞生物藥理學(xué)作用都與其成熟果實中重要化學(xué)成分枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharide,LBP)直接相關(guān)。而LBP由于出色的抗氧化效應(yīng)在抗衰老、抗腫瘤、細(xì)胞調(diào)節(jié)、神經(jīng)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)等多方面有著顯著的功能。本課題前期已經(jīng)報道,LBP通過干預(yù)高脂誘導(dǎo)NAFLD小鼠模型,明顯減少了全身性及肝臟組織中甘油三酯含量。然而,LBP調(diào)節(jié)肝脂質(zhì)代謝的具體機制仍不清楚。正如上文所述,肝臟作為脂肪合成、儲存的主要器官,脂肪酸的合成與氧化平衡是脂代謝最重要的機制,LBP如何調(diào)節(jié)關(guān)鍵的能量代謝調(diào)節(jié)分子SIRT1的基因表達(dá)與活性,如何通過SIRT1/AMPK這個重要的信號通路調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)脂肪代謝?對于上述問題的回答,將為深入理解枸杞多糖藥用價值提供更加深刻、精細(xì)的理論依據(jù)。研究目的證實LBP可能通過SIRT1介導(dǎo)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝;證實LBP可以直接調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)SIRT1表達(dá)及活性;證實LBP可以通過活化SIRT1/AMPK通路改善高脂誘導(dǎo)的NAFLD。研究方法1.采用不同濃度梯度LBP體外孵育Hep G2細(xì)胞24 h,運用NAD+/NADH試劑盒檢測LBP是否增加胞內(nèi)NAD+水平及NAD+/NADH比值;運用WB檢測SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表達(dá)。采用不同濃度LBP與人SIRT1重組蛋白和NAD+底物共孵育1 h,運用SIRT1活性試劑盒檢測LBP是否激活SIRT1去乙�；钚�。采用LBP不同時間孵育Hep G2細(xì)胞,運用WB檢測SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表達(dá)。2.采用LBP孵育Hep G2細(xì)胞24 h,運用IP檢測LBP是否增加LKB1去乙酰化表達(dá);運用WB檢測phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表達(dá)。采用LBP干預(yù)PA處理的Hep G2細(xì)胞,運用WB檢測SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表達(dá);運用油紅O染色及定量分析肝細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況。3.采用LBP干預(yù)SIRT1 si RNA轉(zhuǎn)染的Hep G2細(xì)胞,運用IP檢測LBP對LKB1去乙�；�(yīng);運用WB檢測SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表達(dá)。采用SIRT1 si RNA轉(zhuǎn)染PA處理的Hep G2細(xì)胞后,LBP干預(yù)24 h,運用WB檢測SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表達(dá);運用酶比色法檢測肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。4.采用不同劑量LBP干預(yù)高脂誘導(dǎo)NAFLD模型12周,檢測飲食、飲水、體重、肝濕重及血清甘油三酯變化,運用HE和油紅O染色觀察肝組織的脂滴堆積情況;運用酶比色法檢測肝組織內(nèi)甘油三酯含量;運用ELISA試劑盒檢測血清及肝組織內(nèi)的malonyl-Co A含量;運用q PCR檢測ACC1,FAS,ELOVL6,DGAT及CPT-1α表達(dá);運用WB檢測SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表達(dá)。5.采用p CDH-SIRT1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正�；騊A處理的Hep G2細(xì)胞24 h,運用WB檢測SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表達(dá)。采用SIRT1過表達(dá)慢病毒尾靜脈注射NAFLD小鼠模型,運用HE和油紅O染色觀察肝組織的脂滴堆積情況;運用酶比色法檢測肝組織內(nèi)甘油三酯含量;運用ELISA試劑盒檢測血清及肝組織內(nèi)的malonyl-Co A含量;運用q PCR檢測ACC1,FAS,ELOVL6,DGAT及CPT-1α表達(dá);運用WB檢測SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表達(dá)。6.采用SIRT1 sh RNA慢病毒尾靜脈注射LBP干預(yù)NAFLD模型小鼠,運用HE和油紅O染色觀察肝組織的脂滴堆積情況;運用酶比色法檢測肝組織內(nèi)甘油三酯含量;運用ELISA試劑盒檢測血清及肝組織內(nèi)的malonyl-Co A含量;運用q PCR檢測ACC1,FAS,ELOVL6,DGAT及CPT-1α表達(dá);運用WB檢測SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC,ATGL及FAS表達(dá)。研究結(jié)果1.LBP以濃度或時間依賴性增加SIRT1表達(dá)0-900μg/m L LBP分別孵育Hep G2細(xì)胞24 h,LBP以濃度依賴性增加SIRT1蛋白表達(dá);600μg/m L LBP以0 h,6 h,12 h,24 h,48 h分別孵育Hep G2細(xì)胞,LBP以時間依賴性增加SIRT1蛋白表達(dá)。2.LBP上調(diào)NAD+/NADH比值及增加SIRT1去乙�；钚�300和600μg/m L LBP分別孵育Hep G2細(xì)胞24 h,發(fā)現(xiàn)LBP以濃度依賴性增加了NAD+水平及NAD+/NADH比值;100-600μg/m L LBP分別與人重組蛋白和NAD+底物共孵育1 h,發(fā)現(xiàn)LBP以濃度依賴性上調(diào)了SIRT1去乙�；钚�。3.LBP通過SIRT1增加了LKB1去乙�；磉_(dá)和AMPK磷酸化表達(dá)600μg/m L LBP孵育Hep G2細(xì)胞24 h,通過IP實驗顯示LBP增加LKB1的去乙�；磉_(dá)。0-900μg/m L LBP分別孵育Hep G2細(xì)胞24 h,WB顯示LBP明顯呈濃度依賴性增加phospho-AMPK和phospho-ACC的表達(dá)。250μM PA處理Hep G2細(xì)胞12 h后,600μg/m L LBP干預(yù)0 h,6 h,12 h,24 h,48 h,WB結(jié)果顯示,LBP呈時間依賴性增加phospho-AMPK和phospho-ACC的表達(dá)。4.LBP調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)合成與分解代謝0-900μg/m L LBP分別孵育Hep G2細(xì)胞24 h,發(fā)現(xiàn)LBP呈濃度依賴性減少了肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴堆積,同時增加ATGL表達(dá)和減少FAS表達(dá)。250μM PA處理Hep G2細(xì)胞12 h后,0-900μg/m L LBP干預(yù)24 h,WB結(jié)果顯示LBP依舊可以增加ATGL表達(dá)、減少FAS表達(dá)。5.LBP可在體內(nèi)通過SIRT1/AMPK通路緩解NAFLD100和200 mg/kg LBP干預(yù)高脂喂養(yǎng)小鼠12周,LBP明顯降低小鼠體重及肝濕重;肝臟形態(tài)及染色顯示,LBP明顯減少了肝臟內(nèi)脂滴形成;血清及肝組織甘油三酯測定提示,LBP可以改善高脂誘導(dǎo)的血脂異常;肝組織WB顯示,LBP增加了SIRT1,phospho-AMPK,phospho-ACC和ATGL表達(dá)、減少FAS表達(dá);ELISA實驗顯示,LBP可以明顯降低ACC作用產(chǎn)物malonyl-Co A含量累積;q PCR結(jié)果顯示,LBP明顯抑制脂質(zhì)合成酶表達(dá),而促進脂肪酸氧化酶的表達(dá)。此外,LBP還可以改善小鼠血脂異常和耐量實驗。6.SIRT1過表達(dá)減少肝細(xì)胞內(nèi)的甘油三酯合成通過體外SIRT1質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染及體內(nèi)尾靜脈注射SIRT1慢病毒,我們發(fā)現(xiàn)SIRT1過表達(dá)可以明顯改善肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝,從而緩解高脂誘導(dǎo)的NAFLD。7.SIRT1 sh RNA拮抗LBP調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的效應(yīng)SIRT1 si RNA轉(zhuǎn)染PA處理的Hep G2細(xì)胞并給予LBP干預(yù)24 h,WB和甘油三酯測定結(jié)果顯示,SIRT1 si RNA可以扭轉(zhuǎn)LBP的降脂效應(yīng)。LBP干預(yù)的高脂喂養(yǎng)小鼠模型尾靜脈注射SIRT1 sh RNA慢病毒,繼續(xù)喂養(yǎng)7天。通過HE、油紅O染色及甘油三酯含量測定等實驗,SIRT1 sh RNA明顯抑制了LBP的減脂效應(yīng);WB和q PCR結(jié)果顯示,SIRT1 sh RNA抑制了SIRT1/AMPK信號通路的開放,誘導(dǎo)malonyl-Co A含量增加,加重動物血脂紊亂。研究結(jié)論1.證實LBP可以增加肝細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)與活性。2.證實LBP可以活化肝細(xì)胞內(nèi)SIRT1/AMPK信號通路。3.證實LBP可以通過SIRT1/AMPK通路調(diào)節(jié)肝細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成與分解。
【圖文】：

三種SIRT1siRNA的沉默效應(yīng)

pCDH-SIRT1雙酶切核酸電泳圖
【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
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本文編號：2704724