【摘要】：肝纖維化(Hepatic fibrosis,HF)是肝臟對(duì)各種病因所致慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng),是慢性肝病共有的病理改變,主要特征是以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix,ECM)在肝內(nèi)的過度沉積,導(dǎo)致肝臟結(jié)構(gòu)改變和肝功能喪失。雖然近年來肝纖維化病理機(jī)制研究已取得很大進(jìn)展,但是肝纖維化發(fā)病機(jī)制尚未闡明,臨床上仍缺乏有效的抗肝纖維化藥物。因此,尋找有效的抗肝纖維化藥物和闡明其確切作用機(jī)制具有重要的理論意義和臨床價(jià)值。五味子乙素(Schisandrin B,Sch B)是木蘭科植物五味子中主要的木脂素類成分,具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤及保肝等多種藥理學(xué)活性。近期研究發(fā)現(xiàn),五味子乙素在體外不僅可以抑制TGF-β誘導(dǎo)的纖維化信號(hào)通路,還可以誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞的凋亡。然而,其在體內(nèi)的抗肝纖維化作用及其作用機(jī)制研究卻未見報(bào)道。因此,在本研究中,首先通過構(gòu)建CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型評(píng)價(jià)五味子乙素抗肝纖維化作用效果。然后,采用基于RNA-seq的轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法在基因水平上探討五味子乙素抗肝纖維化作用可能的分子機(jī)制。隨后,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果,進(jìn)一步采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵生物學(xué)過程和信號(hào)通路進(jìn)行研究,進(jìn)一步對(duì)五味子乙素抗肝纖維化作用的分子機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證和補(bǔ)充。最后,通過構(gòu)建肝纖維化疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫,采用在線高通量、快速的“成分-靶點(diǎn)”對(duì)接分析,虛擬篩選五味子乙素可能的生物學(xué)靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上,結(jié)合表面等離子體共振和放射性競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)從親和力的角度對(duì)這些作用靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證,從而在分子靶點(diǎn)層面闡明五味子乙素抗肝纖維化作用的分子機(jī)制。藥理作用評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,五味子乙素顯著的減輕了CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。生化檢測(cè)結(jié)果表明,五味子乙素顯著降低了ALT、AST和Hyp含量,病理切片HE、Masson和Sirius Red染色表明五味子乙素明顯減輕了肝細(xì)胞壞死和膠原纖維化的沉積。此外,我們還采用免疫組化和Western Blot的方法檢測(cè)肝纖維化主要評(píng)價(jià)指標(biāo)α-SMA和Collagen-I的表達(dá)水平,結(jié)果顯示五味子乙素可以降低其表達(dá)水平,這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均說明五味子乙素具有良好的抗肝纖維化作用。在此基礎(chǔ)上,采用高通量測(cè)序的方法對(duì)其進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,結(jié)果顯示五味子乙素組與肝纖維化模型組相比上調(diào)的基因數(shù)為2584個(gè),表達(dá)下調(diào)的基因數(shù)為1659個(gè)。通過GO和Pathway分析,發(fā)現(xiàn)五味子乙素主要影響了氧化還原過程、CCl4的代謝、肝臟的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程。為了驗(yàn)證這些生物學(xué)過程,我們首先通過檢測(cè)氧化應(yīng)激的相關(guān)指標(biāo),結(jié)果顯示五味子乙素降低了肝纖維化模型大鼠中MDA的含量,提高了SOD和GSH-PX的活性,表明五味子乙素減輕CCl4誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激過程。炎癥反應(yīng)是肝纖維化重要的病理過程,通過Real time-PCR檢測(cè)炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6及TGF-β的表達(dá)水平,結(jié)果顯示炎癥因子的表達(dá)水平也被降低了。此外,TUNEL實(shí)驗(yàn)證明了五味子乙素顯著減輕了CCl4誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。由于肝星狀細(xì)胞的活化是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié),因此在體外,我們重點(diǎn)研究了五味子乙素對(duì)肝星狀細(xì)胞增殖、活化的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,五味子乙素可以抑制TGF-β刺激的肝星狀細(xì)胞活化。隨后,對(duì)TGF-β引起的信號(hào)通路進(jìn)行研究,我們發(fā)現(xiàn)五味子乙素主要是影響了TGF-β/Smad和MAPK通路。最后,為了闡釋五味子乙素抗肝纖維化作用的生物學(xué)靶點(diǎn),采用化學(xué)信息學(xué)的方法構(gòu)建肝纖維化疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫,采用高通量對(duì)接軟件,虛擬篩選潛在的生物學(xué)靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步通過放射性競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CB2受體有可能為其作用的靶點(diǎn)。綜上,五味子乙素有效的改善了CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化,采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法在基因水平上研究五味子乙素發(fā)揮抗肝纖維化作用的關(guān)鍵基因及其相關(guān)的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)的結(jié)果,對(duì)肝纖維化發(fā)生、發(fā)展過程中關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究,進(jìn)一步闡釋了五味子乙素抗肝纖維化的作用機(jī)制。最后,通過化學(xué)信息學(xué)的方法尋找五味子乙素可能的作用靶點(diǎn),并通過放射性競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)其作用的靶點(diǎn)有可能為CB2受體。該研究結(jié)果一方面表明五味子乙素具有保肝、抗纖維化等作用,另一方面從信號(hào)通路和生物學(xué)靶點(diǎn)的角度闡釋了其抗肝纖維化的分子機(jī)制,為后期的新藥開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)支持和理論依據(jù)。此外,本論文采用的研究思路和方法,也為尋找治療其它復(fù)雜疾病藥物的靶標(biāo)提供了方法,具有一定的借鑒意義。
【圖文】：

圖 0- 1 肝纖維化發(fā)病機(jī)制（Chem Biol Interact. 2011 Sep 30;193(3):225-31）大量基礎(chǔ)和臨床研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)伴隨著各種肝臟疾病，是其必有的過程，也是肝臟組織損傷是否導(dǎo)致纖維化的重要啟動(dòng)因素，但肝臟組織損傷后是否最終導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)生則與炎癥反應(yīng)與肝組織修復(fù)之間的調(diào)節(jié)功能障礙有關(guān)[19-22]。肝臟組織損傷后，肝臟修復(fù)過程與炎癥反應(yīng)幾乎同時(shí)啟動(dòng)，此外肝臟還具有再生的能力。肝臟再生和修復(fù)過程中，需精密調(diào)控肝臟內(nèi)細(xì)胞的存活和死亡、細(xì)胞生長(zhǎng)和和分化、ECM 的重構(gòu)和降解、細(xì)胞因子的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激等過程的平衡[1,23,24]。一旦當(dāng)參與其中的信號(hào)通路、細(xì)胞因子和細(xì)胞發(fā)生功能異常，就有可能導(dǎo)致肝臟組織修復(fù)失調(diào)，那么當(dāng)肝臟組織發(fā)生過度修復(fù)反應(yīng)時(shí)就會(huì)導(dǎo)致肝纖維化的產(chǎn)生。因此，導(dǎo)致肝纖維化形成的主要原因是肝臟炎癥反應(yīng)和修復(fù)反應(yīng)之間的相互作用而導(dǎo)致的肝組織微環(huán)境改變[22]。肝纖維化微環(huán)境的改變主要包括：①促纖維化細(xì)胞因子的表達(dá)增加，抑制組織纖維化的細(xì)胞因子表達(dá)減少；②基質(zhì)金屬蛋白酶/基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑系統(tǒng)失衡；③氧化系統(tǒng)/抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)；④趨化因子及其受體表達(dá)增加等[23]。因此，肝纖維化微環(huán)境的改變將會(huì)進(jìn)一步加劇肝細(xì)胞損傷，朝著

圖 0- 2 肝纖維化的治療策略（Gut. 2015 May;64(5):830-41）綜上所述，雖然我們對(duì)肝纖維化的發(fā)病機(jī)制及治療也有了一定的進(jìn)展，但是目抗肝纖維化藥物療效并不理想，且副作用較大。因此，繼續(xù)深入研究并開發(fā)安全效及副作用小的抗肝纖維化藥物仍是目前肝臟疾病研究的重點(diǎn)內(nèi)容。（三）五味子乙素的藥理作用研究進(jìn)展五味子（Schisandra chinensis）是木蘭科植物五味子的成熟干燥果實(shí)，《新修本》中記載 五味皮肉甘酸，核中辛苦，都有咸味 ，，故有五味子之名。五味子在中已有兩千多年的藥用歷史，具有斂肺滋腎、生津止汗、澀精止瀉、寧心安神之功。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，五味子提取物具有保肝利膽、補(bǔ)腎安神、抗腫瘤及保護(hù)心血管藥理作用[42,43]。五味子乙素（Schisandrin B，Sch B）是五味子木脂素類成分中最要的活性成分之一，結(jié)構(gòu)如圖 0-3B，分子式為 C23H28O6，分子量為 400.46。大量研究報(bào)道已證實(shí)五味子乙素具有廣泛的藥理學(xué)活性作用，如抗氧化、抗炎、抗腫和保肝等[44-46]。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 王冬堯;陳嘯飛;曹巖;朱臻宇;張俊平;柴逸峰;;生物活性小分子的靶標(biāo)鑒定[J];中國(guó)新藥雜志;2015年10期

2 潘瑤;林劍霞;李妍;;五味子乙素的藥理作用研究概況[J];吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào);2015年01期

3 梁婧;侯海燕;蘭曉霞;孫e

本文編號(hào)：2704843